本發(fā)明是有關(guān)分子式為(I)的A-21978環(huán)狀肽抗菌素衍生物的經(jīng)過改進(jìn)的制備方法，其中R是C2-C14的鏈烷酰基。特別是這種經(jīng)過改進(jìn)的方法包括3在發(fā)酵時(shí)把2個(gè)碳原子到14個(gè)碳原子的鏈烷酸提供給產(chǎn)生A-21978C的培養(yǎng)物。這個(gè)方法的優(yōu)點(diǎn)是：
(1)、生產(chǎn)步驟較原有的方法少，
(2)、產(chǎn)量提高，
(3)、須要的時(shí)間少。
這種A-21978C系列抗菌素是很好的抗菌藥物，A-21978C的諸多衍生物中，具有分子式(I)的一組尤為重要，(也可參見專利號為4,537,717的美國專利。Bernard.J.Abbott，DavidSFukudaandNanuelDebono.)。過去，這些衍生物的制備需要某種多級步驟，該多級步驟費(fèi)時(shí)間，產(chǎn)量低，而且價(jià)格昂貴。而本發(fā)明則提供了制備這些A-21978C衍生物的一種經(jīng)過改進(jìn)的方法。原有的制備一種分子為(I)的衍生物的方法，例如：制備A-21978C的正-癸?；苌?，需要下列步驟：
1、產(chǎn)生A-21978C培養(yǎng)物的發(fā)酵過程
a、用一種液體氮安瓿開始。
b、初級接種步驟(48小時(shí))。
c、二級接種步驟(24小時(shí))。
d、三級接種步驟(24小時(shí))。
e、發(fā)酵(140小時(shí))。
2、過濾，樹脂吸附和洗脫，及濃縮
3、制備t-BOC復(fù)合物(即被保護(hù)的叔丁氧基羰基)
4、對被保護(hù)的復(fù)合物進(jìn)行濃縮
5、脫?；囵B(yǎng)物的發(fā)酵，如使用游動(dòng)放線菌屬
(Actinoplanesutahensis)
a、用一種液體氮安瓿開始。
b、初級接種步驟(72小時(shí))。
c、二級接種步驟(48小時(shí))。
d、發(fā)酵(67小時(shí))。
6、帶有脫?；囵B(yǎng)物的復(fù)合物的脫酰基作用。
7、過濾，樹脂吸附及洗脫，濃縮。
8、再?；饔谩?/p>
9、保護(hù)基團(tuán)的水解。
10、最后進(jìn)行純化。
本發(fā)明的新的方法包括了在發(fā)酵生產(chǎn)步驟中(步驟1的e)，把一種具有2個(gè)碳原子到14個(gè)碳原子的鏈烷酸(一種ROH化合物，其中，R如同上述規(guī)定)，或者它們的一種酯或者鹽，加入到產(chǎn)生A-21978C培養(yǎng)物中，以得到與分子式(I)相對應(yīng)的化合物，使用這個(gè)方法，就可以省去原方法中的3，4，5，6，7，8和9的步驟，此外，這種新的方法可以明顯的提高產(chǎn)量，其所得到的產(chǎn)量大大超過了使用原有方法所獲得的收率。
Streptomyces(鏈霉素)roseosporus菌種NRRL11379(A-21978.6)和NRRL＿＿(A-21978.65)，一種NRRL11379的突變體菌種，是產(chǎn)生A-21978C培養(yǎng)物的有用的菌種。這些培養(yǎng)物它們貯存在北部雷金納(NorthernRegional)研究中心，美國農(nóng)業(yè)部，農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)，伊利諾期州，皮奧利亞市61604借此，可以以登記號為NRRL11379和NRRL＿＿，而向公眾提供。該S-roseoporusNRRL11379培養(yǎng)物和A-21978C抗菌素的生產(chǎn)使用條件，已經(jīng)由RobertL.Hamill和MarvinM.Hoehn在美國專利(US4,331,594)中進(jìn)行說明了，在此處，可以結(jié)合該專利作為參考。
雖然在本發(fā)明的方法中，所指定了的A-21978.6和A-21978.65是較好的微生物菌種，但是任何生產(chǎn)A-21978C的培養(yǎng)物都可以使用。本技術(shù)領(lǐng)域中的技術(shù)熟練的人們會(huì)了解哪種菌種會(huì)對本方法有用。
在美國專利US4,331,591所介紹的天然產(chǎn)生的A-21978C因子是C0，C1，C2，C3，C4和C5。在C1，C2，C3，C4，C5的眾因子中，在式(I)中的R是一種特殊的10個(gè)碳原子到12個(gè)碳原子的烷?；?，A-21978C因子C0，很容易想到，它是一種具有單一支鏈化的，有10個(gè)碳原子的烷?；鶄?cè)鏈，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，它們是二種組份的混合物，二種組份大致的比例為2∶1，其中，主要的組份是帶有10個(gè)碳原子的以支鏈作為側(cè)鏈的組份，較少的組份是具有10個(gè)碳原子的以直鏈作為側(cè)鏈的組份。
為了便于討論，使用本發(fā)明的方法而制備的分子式為(I)的化合物，也稱作A-21978C因子，除了天然產(chǎn)生的因子外，通常用側(cè)鏈的長度表示因子。從而，例如，分子式為(I)的化合物，其中R＝辛?；?，當(dāng)使用本發(fā)明的方法進(jìn)行制備時(shí)，則被稱作一種A-21978C8因子。
在本發(fā)明的方法中，所用的2個(gè)碳原子到14個(gè)碳原子的鏈烷酸，酯或鹽，(基質(zhì)，Theaubstrate)可以是直鏈，也可以是支鏈化合物，例如，為了制備天然產(chǎn)生的A-21978C的因子C1，C2，C3，可以使用一種8-甲基正十二烷酸，10-甲基正十二烷酸，或者10-甲基十一烷酸，酯或者鹽，由于2個(gè)碳原子到14個(gè)碳原子的直鏈酸，酯或鹽容易得到，成本低，因此推薦使用于本方法中，特別好的基質(zhì)，(Substrate)是正-十二烷酸，它的酯或者鹽。
當(dāng)使用2個(gè)碳原子到14個(gè)碳原子的鏈烷酸酯時(shí)，推薦使用C1-C4的烷基酯，在這樣一種酯中，1個(gè)碳原子到4個(gè)碳原子的烷基可以是直鏈，或者是支鏈。
在這個(gè)方法中，所使用的典型的2個(gè)碳原子到14個(gè)碳原子的鏈烷酸的適宜的鹽，包括了鏈烷酸與堿金屬或者堿土金屬所形成的鹽，例如鈉，鉀，鋰，銫，釹，鋇，鈣或鎂。合適的胺鹽包括1個(gè)碳原子到4個(gè)碳原的伯，仲，叔烷基銨鹽和羥基-C2-C4-烷基銨鹽。
這種酶作用物(Substiate)，最好是以無菌液的形式加入到發(fā)酵過程中，用在這種方法的溶劑，雖然可以使用乙醇，醋酸乙酯，和1個(gè)碳原子到4個(gè)碳原子的不飽和脂肪酸的酯，但是特別有用的溶劑是油酸甲酯，如果，這種基質(zhì)，(Thesubstrate)，在發(fā)酵溫度下，是一種適當(dāng)?shù)囊后w，則可以直接把這種基質(zhì)(substrate)加入其中。
這種基質(zhì)(substrate)的加入速率必須是夠低，以避免發(fā)酵中產(chǎn)生中毒作用，不過加入速率高，則可足以提高所希望得到的分子式為(I)的化合物的產(chǎn)量。每小時(shí)對每升發(fā)酵液建議其加入速率大約為0.1到0.2毫升。
在發(fā)酵生產(chǎn)步驟時(shí)，這種基質(zhì)(Sustrate)是生產(chǎn)A-21978C培養(yǎng)物正處于生長階段時(shí)而被加入其中的，從大約在15小時(shí)到32個(gè)小時(shí)才開始加入，并繼續(xù)加入，直至發(fā)酵作用終止。這種基質(zhì)(Substrate)的加入方式可以是以各種不同的方法而加入，但最好的加入方式是能通過某種能更接近于穩(wěn)定流動(dòng)狀態(tài)的方式而加入。
接著，進(jìn)行發(fā)酵，如果需要，則可以用已知的工藝步驟來回收所產(chǎn)生的分子式(I)的化合物(也見美國專利US4,331,594)
本發(fā)明也提供了上面已經(jīng)提到的新型微生物，Streptomyces(鏈霉素)RoseosporusNRRL＿＿，這種微生物也能產(chǎn)生A-21978C抗菌素。本發(fā)明特別涉及到一種經(jīng)過改進(jìn)的，用于生產(chǎn)A-21978C抗菌素的方法，這種方法是通過在液內(nèi)需氧發(fā)酵的條件下，通過培養(yǎng)新型的Steptomycesroseosporus，NRRL＿＿的菌種，直至產(chǎn)生出基本上達(dá)到A-21978C抗菌素的水準(zhǔn)。該A-21978C的抗菌素復(fù)合物可以用極性有機(jī)溶劑從發(fā)酵液和菌絲體中萃取出來，這種A-21978C的各個(gè)因子也可以用本領(lǐng)域中人所共知的技術(shù)如柱上色譜分析法來進(jìn)一步純化。
一般，從天然狀態(tài)中分離出來的培養(yǎng)物(稱野生型“TheWildtype”)，用來生產(chǎn)的抗菌素，其產(chǎn)量低，抗菌素的生產(chǎn)常常是不穩(wěn)定的。因此，使用高效的菌種來不斷地生產(chǎn)抗菌素是有很大的價(jià)值的。
本發(fā)明的目的是提供某種經(jīng)過很大改進(jìn)的用來制備A-21978C抗菌素的方法，該方法是通過培養(yǎng)Streptomyces(鏈霉素)roseosporusNRRL＿＿，或者通過培養(yǎng)某種A-21978C產(chǎn)生的突變體，變異體，或者它們的重組體，在一種培養(yǎng)物培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)物培養(yǎng)基包括可同化源碳源，氮和無機(jī)鹽，在液內(nèi)需氧發(fā)酵的條件下，直至生產(chǎn)出A-21978C的抗菌素。這種A-21978C抗菌素復(fù)合物，或者它的各個(gè)單獨(dú)的因子，可以使用本領(lǐng)域已知的不同的分離和純化步驟來加以回收。
本發(fā)明的這一部份的微生物，已經(jīng)被稱為A-21978.65。這個(gè)菌種是通過菌種選擇和從已經(jīng)被定名為A-21978.6的菌種(NRRL11379)中發(fā)生突變作用而培育出來的。FrederickP.Mertz和Ralph.E.Katne(Lilly研究實(shí)驗(yàn)室)已經(jīng)對這種A-21978.6菌種進(jìn)行了研究和鑒定。該A-21978.6是從土耳其的亞拉拉特山的土塊中選擇出母體菌種而周轉(zhuǎn)培育出來的這種A-21978.6菌種被下列人員即FalcādeMorias和DaliaMaria等人于1961年，被作為新的菌種而歸類于Streptomy-ces(鏈霉素)Rcseosporus。這種分類是與已經(jīng)出版的出版物所敘述的內(nèi)容相比較而作出的〔即R.E.Buchanan和N.E.Gibb-ohs的“Bergey的細(xì)菌學(xué)測定手冊”William和wilkins公司8th.Ed.，1974；和E.B.Shirling及D.Gottlieb，的“鏈霉菌素類菌種的共同說明”intern.JournaloFSystem-aticBacteriol808-809(1972)〕。
這種分類是以國際鏈霉菌素項(xiàng)目所推薦的方法〔E.B.Shirling和D.Gottieb.“鏈霉菌素種的定方法”，在Intern.JournalefSystematicBactriol.16，313-340(1966)〕，以及相關(guān)的輔助實(shí)驗(yàn)作為基礎(chǔ)而作出的。
在ISP9#基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，決定碳的使用的量，在該基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，所加入的碳源，其最終達(dá)到的濃度是1.0％。碳源通過過濾作用而達(dá)到無菌，這種基礎(chǔ)培養(yǎng)基是用高壓滅菌作用而達(dá)到無菌?；?0℃，經(jīng)過14天的接種過程之后，可以被辨認(rèn)出來。
其細(xì)胞壁結(jié)晶，可以利用改進(jìn)的Lechevalier的方法來加以測定，(M.P.Lechevalier，“關(guān)于分離放線菌素到屬的化學(xué)方法”。由美國微生物放線菌委員會(huì)小組專門小組主辦。由Dr.ThomasG.pridham，Convenor；在下列部門舉行，即微生物研究所，Rutgers大學(xué)及在美國的新澤西州，新布魯諾茲友市，新澤西的州立大學(xué)，1971年)。
二氨基庚二酸的異構(gòu)物是利用馬Beoker等人的方法來進(jìn)行測定，(B.Becker，et.al，“利用整個(gè)細(xì)胞水解的紙上色譜方法快速區(qū)分諾卡氏菌(Norcardia)和鏈霉素菌(Streptomyces)”。AppL.Nicrobiol11，421-423(1964)〕。
分析氨基酸是利用洗滌細(xì)胞壁斷裂物的方法來進(jìn)行，類黑色素的測定是利用ISP1#(胰蛋白-酵母菌提取物培養(yǎng)物)，ISP6#(胨-酵母菌提取物，鐵瓊脂)，ISP7#(酪氨酸瓊脂)，改進(jìn)的ISP7#(即ISP7#不含有酪氨酸)，及某種酪氨酸鑒定〔YuzuruMikami，et，al的“改進(jìn)的鏈霉素Arai和Mikani黑色素形成試驗(yàn)”，發(fā)表于Intern.journalofSystematicBactrsiol.27(3)，290(1977)〕。測定淀粉水解物是使用淀粉與碘的實(shí)驗(yàn)方法來進(jìn)行。
利用ISP2#瓊脂培養(yǎng)基，來進(jìn)行溫度范圍，耐Nacl性質(zhì)，PH范圍，和抗菌素敏感性的試驗(yàn)。其溫度范圍是25，28，3034，37，40，45，50和55℃。抗Nacl性質(zhì)是利用把Nacl加入到瓊脂中來進(jìn)行測定。其用量相當(dāng)于0，1，2，3，4，5，6，8，10和12％。這些都是在30℃溫度下進(jìn)行培養(yǎng)。測定PH范圍是調(diào)節(jié)瓊脂使其PH值從3.0到11.0，按每次以1.0的PH單位而遞增，正好在下一次調(diào)節(jié)PH之前來進(jìn)行測定?？咕孛舾行栽囼?yàn)，是使用將敏感性的磁盤墊在已接種的瓊脂板上的方法來進(jìn)行測定的。
其顏色的確定可以按照Iscc-NBS方法(K.L.Kelly和D.B.judd.的“TheIscc-NBS顏色標(biāo)志方法和顏色名稱字典”來進(jìn)行。U.S.DepartmentofCommerceCirc.553，Washington，D.C，1955)。
圓括號中的數(shù)字表示Tresner和Baekus的顏色系列，〔H.D.Trenser和E.j.Backus.的“關(guān)于鏈霉菌素分類學(xué)的色輪系統(tǒng)”，AppLMicrobiol.11335-338(1956年)〕。其色片標(biāo)志可以用在其下部劃一橫線來加以標(biāo)志。其Maerz和paul顏色組可以用括號括出。(A.Naerz和M.R.paul“顏色字典”，McGraw-HillBookCompany.Inc.Newyork.N.Y.1950)
形態(tài)(Morphology)
A-21978.6培養(yǎng)物的形態(tài)包括孢囊柱，該孢囊柱是屬于Rectus-Flexiblilis(RF)分類，孢子的每段鏈長大于10個(gè)孢子(Spore)，孢子的表面柔軟。
A-21978.6培養(yǎng)物是以基本上產(chǎn)生稀薄的紅色的孢子群顏色而作為特征的，并具有微淡紅色—棕色互相交變的顏色。也存在有微棕色的水溶性的色素。在14種瓊脂板培養(yǎng)基中，有三種顯示這種特性，這三種培養(yǎng)基(ISP2#，7#TPO)，被認(rèn)為是由空氣和營養(yǎng)物而大量生長的一類培養(yǎng)基。
有二種瓊脂板培養(yǎng)基，即ISP4#和葡萄糖—天門冬酰胺瓊脂，產(chǎn)生出一種由白到灰的稀薄的孢子群顏色，并具有交變的黃色，沒有觀測到其中有水溶性的色素，這二種培養(yǎng)基被認(rèn)為是較好的培養(yǎng)基，但得到的數(shù)量不多，它們是通過空氣和營養(yǎng)物而生長。
也劑用另外的九種瓊脂板培養(yǎng)基，但是它們僅有少量產(chǎn)生，或者不生長，和不形成芽孢。氣生的顏色存在時(shí)，雖然很少，不過這種氣生的顏色都屬于由白到灰的顏色系列。
類黑色素色素也不存在，主要是由細(xì)胞壁而組成，它們是：LL-二氨基庚二酸，甘氨酸，葡萄糖和核糖。這些都用類型1細(xì)胞壁和類型C糖型來表示(R.E.Buchanan和N.E.Gibbon，Eds，“Becgey的細(xì)菌學(xué)測定手冊”，William&WilkinsCompauy.8fh.Edition1974.P.658)
下列五種培養(yǎng)物是與A-21978.6相比較的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)：
Streptomyces(鏈霉素)Albovinaceous
ISP5136；ATcc15833
Streptomyces(鏈霉素)Candidus
ISp5141；ATcc19891
Streptomyces(鏈霉素)moderatus
ISp5529；ATcc23443
Streptomycesroseosporus
(鏈霉素)ISp5122；ATcc23958
Streptomyces(鏈霉素)Setonii
ISp5395；ATcc25497
這些培養(yǎng)物屬于白色和紅色顏色系列，具有RF型孢囊柱形態(tài)，具有光滑的孢子表面，按照Isp的說明的，是屬于類黑色素負(fù)性，沒有明顯的交替顏色和水溶性色素。這些特征，與碳利用型和其它的第二級特征相結(jié)合，都與A-21978.6的培養(yǎng)物相符合。
在實(shí)驗(yàn)室的條件下，這些培養(yǎng)物與A-21978.6相比較時(shí)，有四種培養(yǎng)物不合乎要求。S.Candidus和S.Setonii在很多培養(yǎng)基中，表現(xiàn)出氣生的黃色孢子群顏色，S.Albovinaceous和S.Moderatus表現(xiàn)出明顯的暗的交變的顏色；水溶性色素，并產(chǎn)生出了類黑色素，所有這些，都與A-21978.6的培養(yǎng)物不同。由ISp，表明S.moderatus是屬于紅棕或強(qiáng)烈的棕色交變顏色，而不屬于S.Albovinaceous一類的特征。這二種培養(yǎng)基都不能列入黑色索類型。
因而，deMorias和DaliáNaia于1961年把A-21978.6培養(yǎng)物分類于Streptomyces(鏈霉素)roseosporus菌種。這種分類是以與出版物說明的內(nèi)容相比較，及直接在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行比較作為塞礎(chǔ)而得到的，下列列出的培養(yǎng)物的特性即概括了直接比較的研究內(nèi)容。
培養(yǎng)特性
形態(tài)(Morphology)
A21978.6S.roseosporus
觀測到孢囊柱直接呈現(xiàn)彎曲形(屬于RF)，沒有觀測到鉤形，環(huán)形和螺形，孢子鏈長＞10。用電子顯微鏡觀測到孢子的表面光滑
孢子：伸長至橢圓伸長到圓筒形
平均：0.85×1.78μM1.01×2.47μM
范圍：0.65-0.970.97-1.3×1.63
×0.99-2.6μM-3.25μM
所含有的培養(yǎng)物的特性
A-21978.6S.roseosporus
生長顏色生長顏色
葫蘿卜柱空氣的：好灰c淡粉無無營養(yǎng)的：數(shù)量多棕色好黃—棕
沒有溶解的色素?zé)o溶解的色索
所含有的培養(yǎng)物的特性
A-21978.6S.roseosporus
生長顏色生長顏色
馬鈴薯柱空氣的：好灰C淡粉無無營養(yǎng)的：數(shù)量多棕色中等橙—棕
暗棕色溶解的色素?zé)o溶解色素
ISpI#(胰蛋白棟—發(fā)酵萃取物瓊脂)空氣的：中等白色(W)a很少白色(W)a營養(yǎng)的：好〔10A1〕淡黃綠很少〔10B2〕淡黃綠
無溶解的色素?zé)o溶解的色素
Isp2#(發(fā)酵—麥芽萃取瓊脂)空氣的：數(shù)量多(R)5cbgy數(shù)量多(R)3Ca淡橙黃
灰黃，淡粉營養(yǎng)的：數(shù)量多〔5D10〕It紅數(shù)量多〔12L7〕1t橄欖
棕有微棕色溶解色素棕色有微棕色的溶解色素
Isp3#(麥片瓊脂)氣生的：中等白色(W)a很少白色(W)a營養(yǎng)的：中等淡黃，淡粉〔10A2〕中等淡綠灰
微棕色的溶解色素?zé)o溶解色素
Isp4#(無機(jī)鹽淀粉瓊脂)氣生的：好白色(W)b好(R)3C2淡橙黃營養(yǎng)的：好淡黃—綠〔10B1〕數(shù)量多〔11I5〕灰黃
微棕色溶解色素?zé)o溶解的色素
所含有的培養(yǎng)物特性
A-21978.6S.roseosporus
生長顏色生長顏色
Isp5#(甘油—天門冬酰胺瓊脂)氣生的：少量(W)13ba紫、白色中等白色(W)b營養(yǎng)的：好〔367〕灰黃、淡粉好灰黃〔10C2〕
淡粉色溶解的色素微棕色溶解色素
Isp7#(酪氨酸瓊脂)氣生的：數(shù)量多黃淡粉(R)5Cb數(shù)量多灰，黃，淡粉
(R)5Cb營養(yǎng)的：數(shù)量多紅棕〔7L12〕mod數(shù)量多黃—棕〔11E5〕
有暗棕色溶解色素棕色溶解色素
Benneff1的改進(jìn)的瓊脂氣生的：無……數(shù)量多灰黃淡粉(R)5Cb營養(yǎng)的：少淡黃棕?cái)?shù)量多灰，黃〔11D4〕
無溶解色素微棕色溶解色素
蘋果酸鈣瓊脂氣生的：無……很少白色(W)a營養(yǎng)的：中等紅棕〔7L12〕很少淡黃—綠
微棕色溶解色素淡黃—綠溶解色素
蔡氏(Czapek)溶液瓊脂氣生的：很少白色(W)a無……營養(yǎng)的：很少無白色無……
無溶解的色素
所含有的培養(yǎng)物特性
A-21978.6S.roseoporus
生長顏色生長顏色
Emerson瓊脂氣生的：很少數(shù)量多(R)5Cb黃、淡粉營養(yǎng)的：數(shù)量多〔13L6〕數(shù)量多〔1115〕gy黃色
無溶解的色素有微棕色溶解色素
葡萄糖—天門冬酰胺瓊脂氣生的：好白色(W)b中等白色(W)b營養(yǎng)的：好灰黃〔12b2〕好〔12B2〕淡黃綠
無溶解色素?zé)o溶解色素
甘油—甘氨酸瓊脂氣生的：很少數(shù)量多白色(W)b營養(yǎng)的：數(shù)量多暗灰.棕〔8L12〕數(shù)量多淡黃〔1OG3〕
棕色的溶解色素淡棕色溶解色素
營養(yǎng)瓊脂氣生的：無中等白色(W)b營養(yǎng)的：很少淡黃—灰好淡黃.灰
無溶解色素?zé)o溶解色素
西紅柿—燕麥糊瓊脂氣生的：數(shù)量多(R)5cb灰.黃.粉數(shù)量多(R)5cb灰.黃.粉營養(yǎng)的：數(shù)量多〔8L12〕暗灰.棕?cái)?shù)量多〔12L7〕黃.棕
棕色溶解色素棕色溶解色素
碳的利用基片A-21978.6S.roseoporusL-阿拉伯糖++D-果糖+-D-半乳糖++D-葡萄糖++i-肌醇--D-甘露糖醇+-D-棉子糖--L-鼠李糖++水楊苷++蔗糖--D-米糖++
說明：+表示正利用碳
-表示負(fù)利用
抗菌素敏感性試驗(yàn)抗菌素含量/盤分類A-21978.6S.roseosporus紅霉素15μg大環(huán)內(nèi)酯物++頭孢菌素30μgβ-內(nèi)酰胺++林肯霉素2μg甘·配糖物--制霉菌素100單位多稀類抗菌素--多粘菌素300單位肽+-鏈霉素10μg氨基甘·配糖物++四環(huán)素30μg四環(huán)素++萬古霉素30μg糖肽++
+＝敏感(抑制帶)
-＝抗藥性(無抑制區(qū))特性A-21978.6S.roseosporus類黑素色素Isp1#(胰蛋白胨—酵母萃取物)--Isp6#(胨—酵母萃取物·鐵)--Isp7#(酪氨酸瓊脂)--Isp7#(改進(jìn)的)(Isp7#中沒有酪氨酸)--酪氨酸試樣--明膠液化作用++脫脂乳作用微量水解微量水解淀粉水解++PH范圍5-115-11溫度范圍25-40℃25-40℃硝酸鹽還原-+耐Nacl性，生長到：10％6％
A-21978.6菌種的某些特性不同于已知的S.roseospo-rus。A-21978.6培養(yǎng)物在孢子大小，葫蘿卜和馬鈴薯柱的生長，防Nacl的性質(zhì)，和在硝酸鹽的還原作用等性質(zhì)方面都和已經(jīng)公開的菌種不同。
本發(fā)明中的A-21978.65菌種具有與A-21978.6的菌種同樣的特性。但是，不同之處在于所生產(chǎn)的A-21978C的抗菌素的總量不同。較早的菌種，每毫升發(fā)酵基中所產(chǎn)生的A-21978C抗菌素，最好的也沒有超過100mcg。而本發(fā)明的經(jīng)過改進(jìn)的A-21978.65的菌種，在罐發(fā)酵中所得到的量至少是上述數(shù)量的2.5倍，而在振蕩瓶中的發(fā)酵中，已經(jīng)得到18倍于上述數(shù)量的產(chǎn)量。具有這種提高產(chǎn)量的A-21978C所產(chǎn)生的特征是，使這種新的菌種能對要得到的各種抗菌素的生產(chǎn)在方法上作出巨大的改進(jìn)。
和其它的有機(jī)體一樣，本發(fā)明產(chǎn)生的新的A-21978C培養(yǎng)基Streptomyces(鏈霉素)roseoporusNRRL＿＿，易發(fā)生變異。NRRL＿＿菌種的重組體，變異體和突變體，可以用已知的，不同的誘變原進(jìn)行處理而得到，例如，紫外線，X-射線，高頻波，放射線和化學(xué)品等。天然的和經(jīng)過誘導(dǎo)而得到的Streptomyces(鏈霉素)roseosporusNRRL＿＿的突變體，變異體和重組體，只要保留了產(chǎn)生A-21978C抗菌素的特性，產(chǎn)量也高，則它們也可以用在本發(fā)明中。
用于StreptomycesroseoporusNRRL＿＿菌種生長的培養(yǎng)基，可以是培養(yǎng)液中的任何一種培養(yǎng)基。例如，可以使用葡萄糖，果糖，半乳糖，麥芽糖，甘露糖，棉子油，油酸甲酯，甘油，精制大豆油等，然而，就生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性，最佳產(chǎn)率和容易離析等方面來說，在大范圍的發(fā)酵過程中，一種最好的碳源卻是木薯糊精。
關(guān)于氮源，雖然可以利用可溶性的肉胨，大豆粉，大豆水解產(chǎn)物，大豆渣，酵母，氨基酸類像L-天門冬酰氨和DL-亮氨酸等，但是一種較好的氮源是一種水解酪蛋白酶。
可以與培養(yǎng)基配合使用的無機(jī)鹽營養(yǎng)物，是可以形成鉀，銨，氯化物，硫酸鹽，硝酸鉀鹽等離子的可溶性的鹽，其中，K2So4在抗菌素生產(chǎn)中最有用，糖蜜灰，灰滲析液，和合成的無機(jī)混合物等也有用。
生產(chǎn)A-21978C抗菌素時(shí)，在其發(fā)酵培養(yǎng)基中最好使用蒸餾水或者去離子水，在自來水中，如果存在如鈣和碳酸鹽等無機(jī)物，則會(huì)對抗菌素的生產(chǎn)起阻礙作用。
用于微生物的生長發(fā)育所必須的基本微量元素也應(yīng)該包括在菌種培養(yǎng)基中。這種微量元素一般是在其它培養(yǎng)基的結(jié)構(gòu)中，作為不純物而存在的，其含量足以滿足微生物生長所需要的量。
如果在大范圍發(fā)酵過程中，發(fā)泡作用影響發(fā)酵，則必須加入某種少量防泡劑(用量為0.2毫升/每升)如加入聚丙烯乙二醇到發(fā)酵培養(yǎng)基中。
大量生產(chǎn)A-21978C抗菌素，最好在罐內(nèi)進(jìn)行，用液內(nèi)需氧發(fā)酵方法。不過，也可以用震動(dòng)一搖瓶培養(yǎng)法來得到少量的A-21978C抗菌素。
由于在微生物的生產(chǎn)中，其時(shí)間滯后通常與大罐的接種，及微生物的孢子形式有關(guān)系，因此，最好是利用某種營養(yǎng)接種物。這種營養(yǎng)接種物是利用孢子形式，或者微生物的菌絲體的斷片來接種某種小量的培養(yǎng)物培養(yǎng)基，以得到某種新鮮的、有活性的，微生物菌種生長培養(yǎng)物，然后再把這種營養(yǎng)物移植到一種大罐中。
這種新產(chǎn)生的A-21978C的微生物，可以在溫度為20℃和40℃之間的溫度進(jìn)行生長培育。A-21978C的生長的最適宜的條件為在溫度30℃到32℃為好。
通常，在液內(nèi)需氧培養(yǎng)的方法中，無菌空氣被通過培養(yǎng)物培養(yǎng)基而擴(kuò)散。為了有效的生產(chǎn)A-21978C的抗菌素，在罐內(nèi)生產(chǎn)所用的飽和空氣的百分含量應(yīng)該高于20％，最好是高于30％(溫度為30℃和壓力為1個(gè)大氣壓)
罐內(nèi)發(fā)酵，最好保持發(fā)酵培養(yǎng)基的PH范圍在大約6.5-7.0。這可以通過加入適當(dāng)量的如氫氧化鈉(在開始步驟)和加入鹽酸(在最后步驟)而作到這一點(diǎn)。
A-21978C抗菌素產(chǎn)品能在發(fā)酵期間，通過測定液體培養(yǎng)液或菌絲體固體提取物樣品，用已知對抗菌素過敏的有機(jī)體作對比，來測定抗菌素的活度。在測定這些抗菌素時(shí)，一種常用的鑒定有機(jī)體是黃球菌(MicrococcusLuteus)。生物鑒定是通過紙盤在瓊脂板上來完成的。
另外，培養(yǎng)物固體，包括培養(yǎng)基成分和使用沒被提取或分離的菌絲體，但最好是去除水份后，選擇來作為A-21978C抗菌素的來源。例如，在A-21978C活性抗菌素的生產(chǎn)之后，培養(yǎng)基能用在真空中的冷凍狀態(tài)下蒸發(fā)水份的方法來干燥，混合后直接進(jìn)入供給預(yù)混合料中。
結(jié)構(gòu)式I的化合物是的抗菌素劑。
為了很完全地說明本發(fā)明的操作，下面提供了未加限制的例子。
例一
A-21978C復(fù)合物的生產(chǎn)
在液氨的汽化相中制備和保存一種原種培養(yǎng)物。Streptomy-cesroseosporusNRRL＿＿，在液氨的汽化相中予先給以保存，然后使用50毫升的下列組合物的營養(yǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行接種。
成分?jǐn)?shù)量(％)胰蛋白酶大豆液體培養(yǎng)基〔Tryptlcase3.0
soyBroth*〕
糊精2.5
水(去離子)94.5
*Baltimore生物實(shí)驗(yàn)室，CockeysvilleMD
接種后的培養(yǎng)基放在一個(gè)250毫升的錐形瓶中，該燒瓶放在一個(gè)二英寸的拱形板的旋轉(zhuǎn)振蕩器上，轉(zhuǎn)速為250轉(zhuǎn)/分鐘，于30℃培養(yǎng)48小時(shí)。然后將成熟的營養(yǎng)培養(yǎng)物分散到多個(gè)(0.5毫升)的容器中，并在液氨的汽化相中儲(chǔ)藏。
為了提供大量均勻的供應(yīng)儲(chǔ)存物品，用在液氨中1毫升的培養(yǎng)儲(chǔ)存物接種到80毫升的上面所討論的營養(yǎng)培養(yǎng)基上，把接種后的營養(yǎng)培養(yǎng)基放一個(gè)250毫升的錐形瓶中，該燒瓶放在一個(gè)二英寸的拱形板的旋轉(zhuǎn)振蕩器上，轉(zhuǎn)速為250轉(zhuǎn)/分鐘，于30℃培養(yǎng)48小時(shí)。
用10毫升的這種培養(yǎng)物來接種到450毫升的有如上面所描述的第一階段營養(yǎng)培養(yǎng)基相同組成的第二階段營養(yǎng)生長培養(yǎng)基上。第二階段的培養(yǎng)基放在一個(gè)2升的錐形燒瓶中，該燒瓶放在一個(gè)2英寸的拱形板的旋轉(zhuǎn)振蕩器上，轉(zhuǎn)速為250轉(zhuǎn)/分鐘，于30℃，培育24小時(shí)。
使用1升的第二階段的營養(yǎng)培養(yǎng)物接種到39升的有下列成分的無菌的第三個(gè)接種物生長培養(yǎng)基上：
成分?jǐn)?shù)量(％)大豆蛋白粉〔SoybcanFlowr〕0.5酵母萃取物a0.5葡糖酸鈣1.0Kclb0.02MgSO4.7H2Ob0.02FeSO4.7H2Ob0.004Sag471〔防泡)0.03水97.9296a、Difco實(shí)驗(yàn)室，DetroitMIb、如下面方法來制備微量無機(jī)物：
將FeSO4.7H2O(7.6克)溶解在經(jīng)濃縮的Hcl(76毫升)，然后加入MgSO4.7H2O(380克)，Kcl(380克)和去離子的水使總體積為3800毫升，為了提供滿意的無機(jī)物，使用每39升的第三個(gè)接種物生長階段的80毫升的溶液。c、UnionCarbide，DanbnryCT
接種后的培養(yǎng)基在一個(gè)不銹鋼容器中于30℃培育24小時(shí)，容器中以0.85V/V/m的速度充以無菌空氣，并用常規(guī)的攪拌器攪拌，轉(zhuǎn)速為350～450轉(zhuǎn)/分鐘，容器中的壓力保持在5泊斯卡(PSIG)。
使用1升的培育后的第三個(gè)接種體階段產(chǎn)物來接種到有下列組成的119升的無菌產(chǎn)品培養(yǎng)基上：
成分?jǐn)?shù)量(％)大豆蛋白粉〔SoybeanFlour〕2.2Fe(NH4)2SO4.6H2O0.066葡萄糖0.825Sag4710.022土豆糊精3.3糖漿(乳化黑色油)0.275自來水93.312
在加入第一、二種成分之后，將PH調(diào)節(jié)到7.0，接著加入所有的成分，立刻消毒滅菌一段時(shí)間。
接種后的產(chǎn)品培養(yǎng)基在一個(gè)不銹鋼容器中，于30℃并以0.5V/V/m的速度充以無菌容氣，培養(yǎng)6天。培養(yǎng)基用常規(guī)的攪拌器攪拌，在速度為250轉(zhuǎn)/分鐘時(shí)，攪拌0～15小時(shí)，和在速度350轉(zhuǎn)/分鐘時(shí)，攪拌15小時(shí)，加入氫氧化胺(NH3.H2O)來保持PH值等于或超過6.5。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，A-21978C復(fù)合物的產(chǎn)量是每升發(fā)酵液體培養(yǎng)液為0.282克，因子分析如表一所描述的。
例2
增加A-21978C8的產(chǎn)量
進(jìn)行如例1所描述的第一，第二，第三生長步驟。最初的生產(chǎn)步驟除列1描述的之外，開始時(shí)含有50％V/V辛酸(GH151OOH)和甲基油酸鹽的無菌溶液以每小時(shí)每升發(fā)酵液體培養(yǎng)液0.13毫升的速率供給發(fā)酵體28小對，以這個(gè)速度，經(jīng)144小時(shí)直到發(fā)酵結(jié)束。A-21978C復(fù)合物的產(chǎn)量是每升液體培養(yǎng)液1.255克，比例1獲得的產(chǎn)量增加445％。因子A-21978C8〔結(jié)構(gòu)式I的化合物，其中R是辛(酰)基〕代表用這個(gè)方法制備出的總的A-21978C合成物的9％。在用例1的方法制備出的A-21978C復(fù)合物中沒有測出有A-21978C8。
例3
增加A-21978C9的產(chǎn)量
進(jìn)行如例1所描述的第一，第二和第三步培養(yǎng)生長步驟，最初的生產(chǎn)步驟除例1描述的之外，開始時(shí)含有25％V/V壬酸和75％甲基油酸鹽以每小時(shí)每升發(fā)酵液體培養(yǎng)液0.13毫升的速率供給發(fā)酵體28小時(shí)，以這個(gè)速度時(shí)，經(jīng)144小時(shí)直到發(fā)酵結(jié)束。A-21978C合成物的產(chǎn)量是每升液體培養(yǎng)液肉湯0.821克，超過例1獲得的產(chǎn)量293％。因子A-21978C9〔結(jié)構(gòu)式I：R是壬酰基(CH3(CH2)7CO-)〕代表用這個(gè)方法制備出的總的A-21978C復(fù)合物的10％。在用例1的方法制備出的A-21978C復(fù)合物中沒有測出有A-21978C9。
例4
增加A-21978C10的產(chǎn)量因子A-21978C10〔結(jié)構(gòu)式I：R是癸酰基〕
進(jìn)行如例1所描述的第一，第二步營養(yǎng)生長培育步驟，在第三步，使用800毫升的第二步接受體培養(yǎng)物接種到有下列組成的950升的無菌的第三個(gè)接受體生長培養(yǎng)基上。
成分?jǐn)?shù)量(％)
葡萄糖2.0
碳酸鈣0.2
大豆蛋白粉(SoybeanFlour)2.0
酵母萃取物0.1
Kcla0.02
MgSO4.7H2Oa0.02
FeSO4.7H2Oa0.0004
Sag471(防泡)0.02
水95.6396
a、如例1所描述的方法來制備微量無機(jī)物溶液。
經(jīng)接種后的培養(yǎng)基在一個(gè)不銹鋼容皿中于30℃培育24小時(shí)，容器中以0.8V/V/m的速度充以無菌空氣并用常規(guī)的攪拌器攪拌。用1升的這種第三步接受體來接種到119升有如例1描述的組成的生產(chǎn)步驟培養(yǎng)基上。除了例1所敘述的開始步驟之外，在開始了28個(gè)小時(shí)，把一個(gè)含有50％V/V的癸酸和50％的甲基油酸鹽的無菌溶液以每小時(shí)每升發(fā)酵液體培養(yǎng)物0.26毫升的速率進(jìn)入發(fā)酵體，保持這個(gè)速度，經(jīng)283個(gè)小時(shí)，直到發(fā)酵結(jié)束。A-21978C復(fù)合成物的產(chǎn)量是每升液體培養(yǎng)液1.94克，比用例1的方法增加687％。濃縮A-21978C10因子(結(jié)構(gòu)式I：R是N-癸?；车妹可?.63克或總的A-21978復(fù)合物的84％，這比用例1的方法所得到的A-21978C10大13583％。
例5
增加A-221978C10產(chǎn)量的另外方法
進(jìn)行如例1所描述的第一，第二和第三個(gè)接種體生長步驟。除了最初的生產(chǎn)步驟如例1所描述的之外，開始了28小時(shí)，把一個(gè)含有25％V/V的辛酸乙基酯(乙基辛酸酯)和甲基油酸脂的無菌溶液以每小時(shí)每升發(fā)酵液體培養(yǎng)液0.13毫升的速率加到發(fā)酵體中，保持這個(gè)速率，經(jīng)144小時(shí)直到發(fā)酵結(jié)束，A-21978合成物的產(chǎn)量是每升1.022克，比用例1方法所得到的產(chǎn)物增加362％。濃縮A-21978C10因子是每升0.202克或總的A-21978C合成物的20％。這比用例1的方法所生產(chǎn)的濃縮A-21978C10的產(chǎn)量大1683％。
例6
增加A-21978C10產(chǎn)量的另外方法
進(jìn)行如例1所描述的第一，第二步營養(yǎng)生長培養(yǎng)步驟。除了第三步接受體如例4所描述的培養(yǎng)之外，培養(yǎng)基的體積是1900升，這一步驟持續(xù)48個(gè)小時(shí)。從0～24小時(shí)充氣速率為0.3V/V/m，從24～40小時(shí)，充氣速率為0.45V/V/m，從40～48小時(shí)，充氣速率為0.90V/V/m。最初的生產(chǎn)步驟如例1所描述的。在23小時(shí)之內(nèi)，把0.004％的酵母萃取物的無菌懸浮液成批供給發(fā)酵體。開始36小時(shí)，丙三醇和癸酸銨溶液以每小時(shí)每升發(fā)酵液體培養(yǎng)液0.84毫升的速率供給。供給的溶液含有丙三醇(3600克)、去離子水(9000毫升)、辛酸(1升)和濃縮的氫氧化胺溶液(620毫升)。在這個(gè)速率下保持供給143小時(shí)，直到發(fā)酵結(jié)束。A-21978C合成物的產(chǎn)量是每升1.772克，比用例1方法獲得的產(chǎn)品產(chǎn)量增加628％，濃縮A-21978C10因子經(jīng)測定是每升0.739克或是總的A-21978C合成物的42％，這比用例1方法生產(chǎn)的濃縮A-21978C10的產(chǎn)量大6158％。
例7
增加A-21978C11的產(chǎn)量
進(jìn)行如例1所描述的第一，第二和第三個(gè)接種步驟。除了最初的生產(chǎn)步驟如例1描述的之外，開始28個(gè)小時(shí)內(nèi)，一個(gè)含有25％V/V十一烷酸和75％的甲基油酸鹽的無菌溶液以每小時(shí)每升發(fā)酵液體培養(yǎng)液0.13毫升的速率加到發(fā)酵體中，在144小時(shí)內(nèi)直到發(fā)酵結(jié)束。A-21978C合成物的產(chǎn)量是每升1.62克，這比用例1方法所得到的A-21978C10的產(chǎn)量高574％。濃縮A-21978C11因子〔結(jié)構(gòu)式I：R是十一?；辰?jīng)測定是每升0.70克，或是總的A-21978C復(fù)合物的43％。在通過用例1方法制備的A-21978C復(fù)合物中沒有發(fā)現(xiàn)A-21978C11因子。
例8
增加A-21978C5的產(chǎn)量
進(jìn)行如例1所描述的第一，第二和第三步接種步驟，除了最初的生產(chǎn)步驟如例1描述的之外，在開始的28個(gè)小時(shí)之內(nèi)，一個(gè)含有25％V/V的十二烷酸和75％甲基油酸鹽的無菌溶液以每小時(shí)，每升發(fā)酵液體培養(yǎng)液0.13毫升的速率加入到發(fā)酵體中，在144小時(shí)內(nèi)直到發(fā)酵結(jié)束。A-21978C合成物的產(chǎn)量是每升1.12克比用例1的方法產(chǎn)品增加400％，濃縮因子A-21978C5〔結(jié)構(gòu)式I：R是十二烷?；辰?jīng)測定是每升0.372克或是總的A-21978C復(fù)合物的33％。這比用例1方法制備的A-21978C合成物中發(fā)現(xiàn)的濃縮A-21978C5大5314％。
例9
生產(chǎn)A-21978C合成物的其它方法
使用例1的方法制備A-21978C復(fù)合物，但使用Strepl-omycesreseosporusNRRL11379培養(yǎng)物。
例10
增加A-21978C10產(chǎn)量的其它方法
使用例6的方法制備A-21978C10，但使用Streptomy-cesreseosporusNRRL11379培養(yǎng)物。
例11
振蕩瓶生產(chǎn)的A-21978C合成物
使用如例1描述的一般方法，但在振蕩瓶條件下，使用下列發(fā)酵培養(yǎng)基：
成分?jǐn)?shù)量(％)
葡萄糖7.5
糊精a30
酶水解酪蛋白b5
胨c5
糖漿2.5
去離子水總量為1升
a、Stadex11，A、E，Staleyco，DecaturIL
b、NZAmineA，HumkoShebbieldchemical
LyndurstNJ
c、Biosate，BaltimoreBiologicallabor-
atories，CoekeysvilleMD
從這個(gè)發(fā)酵體中得到的A-21978C合成物的產(chǎn)量是每升液體培養(yǎng)物1800mcg。
表1不同的脂肪性基質(zhì)對生產(chǎn)A-21978C組成的影響
A-21978C組成(毫克/毫升)a、b例子類酯性基質(zhì)C1C2C3C5C8C9C10C111無77113727//12c/2辛酸276312214175113/170/3壬酸147177125192/8390/4癸酸135504877//1630d/5癸酸乙基酯168246156251//202d/6癸酸銨33537122898//739d/7十一烷酸163206158273//1187008十二烷酸204236141372//173/a、在過濾后液體培養(yǎng)液里抗菌素組成的濃度用高性能的液體色譜法來評價(jià)，不同的組成通過紫外光吸收來測定。b、C0，C1，C2，C3和C5是天然發(fā)生的A-21978C因子；C8，C9，C10和C11是結(jié)構(gòu)式I的化合物，其中R＝C8，C9，C10和C11分別代表?；鶊F(tuán)。c、自然因子C0。d、實(shí)際上發(fā)現(xiàn)R是N-癸?；?/p>
勘誤表文件名稱頁行補(bǔ)正前補(bǔ)正后權(quán)利要求書說明書2335691821222326131614倒5581318倒221381415182149倒51NRRL＿＿，″或者?？咕兀琋RRL＿＿，″″″″″″FlexiblilisNRRL＿＿，″″″″0.004(GH151OOH)A-21978NRRL15998，″或重組體。復(fù)合物，NRRL15998，″″″″″″FlexibilisNRRL15998，″″″″0.0004(C7H15COOH)A-21978C