本發(fā)明涉及幾種能表達(dá)某些肽和蛋白質(zhì)的病毒。這些肽和蛋白質(zhì)與淋巴結(jié)病病毒（LAV）和人體T-細(xì)胞白血病病毒（HTLV-Ⅲ）的表位以及淋巴結(jié)病綜合征（LAS）和后天免疫缺乏征（AIDS）的病源因素有關(guān)。

本發(fā)明涉及的能夠表達(dá)導(dǎo)致保護(hù)性免疫應(yīng)答的LAV/HTLVⅢ相關(guān)肽的病毒，可以作為免疫原用于針對(duì)LAS或AIDS的病毒疫苗配方或多功能疫苗的配方。事實(shí)上本發(fā)明涉及的傳染性病毒在宿主中繁殖但不導(dǎo)致疾病，因而能用于活的病毒疫苗配方作為延長免疫的刺激作用，并且升高實(shí)際的免疫力。

本發(fā)明還涉及某些與LAV/HTLVⅢ表位有關(guān)的肽和蛋白質(zhì)，該特定的肽或蛋白質(zhì)可在LAS或AIDS亞單位疫苗配方中作為免疫原或用于多價(jià)疫苗配方或作為抗原用于LAS或AIDS的診斷免疫測(cè)定。這些肽和蛋白質(zhì)可以在任何載體宿主系統(tǒng)中通過DNA重組技術(shù)獲得或者通過化學(xué)合成方法獲得。因而，本發(fā)明還涉及對(duì)DNA新順序和載體結(jié)構(gòu)的解釋，這些載體和DNA包括質(zhì)粒DNA和寄生于人體、動(dòng)物或昆蟲的病毒DNA，或者噬菌體。該噬菌體在合適的宿主中可以指導(dǎo)LAV/HTLVⅢ相關(guān)肽和蛋白質(zhì)的表達(dá)，因而可以從相應(yīng)宿主細(xì)胞中純化上述的肽和蛋白質(zhì)。本發(fā)明還描述了化學(xué)合成LAV/HTLVⅢ相關(guān)肽和蛋白質(zhì)的方法。

本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例，使用重組體牛痘病毒制備LAV/HTLVⅢ外殼或核心的相關(guān)蛋白質(zhì)。編碼LAV/HTLVⅢ外殼糖蛋白或核結(jié)構(gòu)蛋白的env或gagDNA順序被分別地插入到能指導(dǎo)LAV/HTLVⅢ基因在合適的宿主中表達(dá)的牛痘載體。通過重組牛痘病毒產(chǎn)生的LAV/HTLVⅢ外殼相關(guān)蛋白，對(duì)于低于人類的靈長目動(dòng)物可以作為抗原和免疫原并且能誘導(dǎo)體液或細(xì)胞調(diào)節(jié)的免疫。由重組體牛痘病毒產(chǎn)生的LAV/HTLVⅢgag相關(guān)蛋白質(zhì)是具有免疫反應(yīng)性的蛋白質(zhì)，它含有了大部分真核蛋白的表位。

在病毒疫苗中，可以表達(dá)LAV/HTLVⅢ外殼相關(guān)蛋白的重組牛痘病毒可以單獨(dú)使用，或者連同表達(dá)其他LAV/HTLVⅢ相關(guān)蛋白（如核結(jié)構(gòu)蛋白）的牛痘重組體一起使用。另一方面，重組病毒產(chǎn)生的LAV/HTLVⅢ相關(guān)蛋白可以純化或用化學(xué)法合成并在亞單位疫苗配方中用作免疫原。由于LAV/HTLVⅢ相關(guān)蛋白在宿主動(dòng)物體內(nèi)被視為“外來物”而發(fā)生由體液和/或細(xì)胞調(diào)節(jié)的免疫應(yīng)答以抵御某種蛋白質(zhì)或其組合體。由于這種免疫應(yīng)答的存在，利用合適的疫苗配方可以保護(hù)宿主避免LAV/HTLVⅢ的隨后感染。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，重組桿狀病毒（Autogroaphacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus或AcNPV）用于制備LAV/HTLVⅢ外殼和核的相關(guān)蛋白。編碼外殼蛋白或核結(jié)構(gòu)蛋白的env或gag的DNA順序分別地被插入桿狀病毒載體，該載體在合適的宿主中可以指導(dǎo)LAV/HTLVⅢ基因的表達(dá)。重組桿狀病毒產(chǎn)生的LAV/HTLVⅢ蛋白經(jīng)放射免疫沉淀法和ELISA測(cè)定證明具有抗原性。

本發(fā)明也提供LAV/HTLVⅢ抗原產(chǎn)品，在醫(yī)藥方面具有普遍的重要意義。如本發(fā)明所述的特定的肽和蛋白質(zhì)在免疫測(cè)定法中作為試劑而使用。作為診斷工具在ELISA試驗(yàn)和放射免疫測(cè)定法中測(cè)定抗體對(duì)于血樣、體液、組織中的LAV/HTLVⅢ的專一性。此外，這些試劑在描述LAV/HTLVⅢ的發(fā)病機(jī)制方面也是一個(gè)有使用價(jià)值的工具。

愛滋病毒

后天性免疫缺乏征是一種主要由于病人細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答能力的缺乏而引起的嚴(yán)重的免疫缺乏征。（Gottlieb，M.etal.，1981，N.Engl.J.Med.305∶1425;Masur，J.etal.，1981，N.Engl.J.Med.305∶1431）?，F(xiàn)舉兩例對(duì)該病的臨床癥狀作描述：（a）稱為淋巴結(jié)綜合征（LAS）的前期，其特征為慢性的淋巴結(jié)征，白細(xì)胞減少和外周血液輔助細(xì)胞（OKT4細(xì)胞）減少導(dǎo)致正常外周輔助T淋巴細(xì)胞與抑制T淋巴細(xì)胞的比例（OKT4∶OKT8）從2逆轉(zhuǎn)至0.1并隨病情的惡化進(jìn)一步下降;（b）免疫缺乏癥狀，特征為OKT4細(xì)胞的減少和正常OKT4與OKT8比例的逆轉(zhuǎn)，淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量減少和主要由卡氏肺囊蟲引起的反復(fù)感染;對(duì)于大部分病例后期的病情最終導(dǎo)致患者死亡。有些患者還出現(xiàn)淋巴瘤和卡波濟(jì)氏肉瘤的惡化現(xiàn)象。目前還沒有方法可以活愈或治療該疾病。

從綜合各種情行的患者的流行病學(xué)數(shù)據(jù)來看，致病原因?yàn)榻佑|傳染物。下列三個(gè)小組提供的證據(jù)將有力證明AIDS的致病因素，是一種對(duì)于輔助T淋巴細(xì)胞有一種向性的逆行病毒（retrovirus）。

（a）R.C.Gallo及其同事于國家健康研究院從愛滋病及初期AIDS患者身上分離出一種使細(xì)胞致病的逆行病毒（retrovirus）（HTLVⅢ）Gallo，R.C.etal.，1984，Science224∶500;Popovic，M.etal.，1984，Science224∶497）他們還檢測(cè)了與AIDS病患者血清中HTLVⅢ對(duì)抗的抗體。

（b）L.Montagnier及其同事于巴斯德研究院從一位患頸部淋巴結(jié)癥而被懷疑患了AIDS病的患者身上分離出一種T-淋巴營性的逆行病毒（retrovirus）（LAV/HTLVⅢ）。Barre-Sinoussi，F(xiàn).，etal.，1983，Science220∶868）該小組同樣還從AIDS病患者血清中得到抗LAV/HTLVlll的抗體。（Kalyansraman，V.S.，etal.，1984，Science225∶321）甚至他們還從一位因接受了AIDS病患者的獻(xiàn)血而染上AIDS病的患者的淋巴細(xì)胞中分離出LAV/HTLVⅢ。（Feorino，P.M.，etal.，1984，Scienee225∶69）。

（c）J，Levy及其同事們從AIDS病患者的外周單核細(xì)胞中分離出傳染性的逆行病毒（retrovirus）（術(shù)語稱為AIDS病相關(guān)逆行病毒或ARV）（Levy，J.A.，etal.，1984，Science225∶840）。

盡管三種病毒各自獨(dú)立地被分離出來，但是它們也許屬于共同的逆行病毒亞組（subgroup）（Levy，J.A.，etal.，1984，Science225∶840），在此統(tǒng)稱為LAV/HTLVⅢ。

逆行病毒的一般結(jié)構(gòu)為在一個(gè)核糖蛋白的核芯外由包括外殼在內(nèi)的類脂層包裹著，外殼是在細(xì)胞芽生階段形成的。植入外殼和留在外面的是由病毒編碼的糖蛋白。這些物質(zhì)決定了病毒的宿主種類并和易感細(xì)胞外表的受體產(chǎn)生專一性反應(yīng)?？梢钥紤]中和抗體結(jié)合在外殼糖蛋白上并阻止與細(xì)胞表面受體之間的互相作用。（PP.534-535的，TheMolecularBiologyofTumorViruses，ed.J.Tooze，1973，ColdSpringHarborLaboratory;PP.226-227and236-237in，RNATumorViruses，ed.R.Weiss，N.Teich，H.Varmus，andJ.Coffin，1982，coldspringHarborLaboratory.）在特殊情況下可以肯定，存在于一類T-淋巴細(xì)胞的T4抗原為LAV/HTLVⅢ病毒的受體或受體的組成部份。（Dalgeish，A.G.，etal.，1984，Nature312∶763;Klatzma-nn，D.，etal.，1984，Nature312∶767）。

圖1表示的為LAV/HTLVⅢ的RNA染色體。其中有三個(gè)基因常常提到。gag基因編碼病毒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)蛋白（核蛋白）并確定病毒的類屬特性抗原。

pol基因編碼與逆轉(zhuǎn)錄酶有關(guān)的病毒粒子。env基因編碼病毒糖蛋白。及以sor和3′-orf標(biāo)記的表示該染色體包含空位譯讀結(jié)構(gòu)的區(qū)域，但是對(duì)其功能目前還不了解。

疫苗

目前使用許多方法以預(yù)防和治療病毒感染。包括使用能引起免疫應(yīng)答的疫苗、化學(xué)藥劑及干擾素。傳統(tǒng)制備疫苗的方法有使用去活病毒或使用活性堿弱病毒兩種。滅活病毒是一種無害的生物藥劑同時(shí)又保留了引起免疫的能力。這些“被殺死的”病毒顆粒射入宿主后引起免疫應(yīng)答以抵抗此后由活病毒引起的感染。然而關(guān)鍵在于使用的病毒疫苗不能做到殺死所有的病毒顆粒，而且即便能夠做到這一點(diǎn)，由于滅活的病毒在宿主中不能繁殖，免疫作用時(shí)間太短，往往需要重復(fù)進(jìn)行疫苗注射。此外，滅活過程可能改變病毒蛋白而使免疫活性下降。

病毒制品經(jīng)過毒性減弱作用基本上喪失了致病的能力。使病毒減毒的方法是使病毒在異常的條件下生長和/或在細(xì)胞培養(yǎng)中頻繁地進(jìn)行繼代培養(yǎng)。然后選出毒力減低的病毒突變體，這種突變體保留了誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力。用減弱毒力的病毒因其可以在宿主中繁殖而使免疫作用時(shí)間持續(xù)很久，因而作為免疫原往往比較理想。但是使用活的疫苗也存在若干問題，其中最令人擔(dān)心的是毒力的降低是否已經(jīng)足夠。

采用亞單位疫苗的辦法與前述方法相對(duì)照。此免疫方法是僅僅針對(duì)那些有免疫學(xué)相關(guān)的蛋白質(zhì)的。許多含外殼病毒編碼的糖蛋白含有能誘導(dǎo)中和抗體的抗原表位。例如，LaCrosse病毒的糖蛋白（Gonzalez-Scarano，F(xiàn).，Shope，R.E.，Calisher，C.E.andNathanson，N.，1982，Virobogy120∶42.），新生期的小牛腹瀉病毒（calfDiarrheavirus）（Matsuno，S.andInouye，S.，1983，《感染與免疫》39∶155）InfectionandImmunity委內(nèi)瑞拉型馬腦脊髓炎病毒（Mathews，J.H.andRoehrig，J.T.，1982，JImm.129∶2763），PuntaToro病毒（Dalrymple，J.M.，Peters，C.J.，Smith，J.FandGentryM.K.，1981，ln《陰性單鏈病毒的復(fù)制》，D.H.L.BishopandR.W.Compans，eds.，P.167.Elsevier，Newyork），鼠白細(xì)胞病毒（steeves，R.A.，strand，M.andAugst，J.T.，1974，J.Virol.14∶187），及鼠乳房腫瘤病毒（Massey.，R.J.andSchochetman，G.，1981，Virology115∶20）.亞單位疫苗的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)為排除了不相干的病毒物質(zhì)。

疫苗常輔以佐劑。佐劑有助于提高耐受性和免疫水平，使用的免疫原的劑量較單獨(dú)使用時(shí)少的得多。佐劑的作用機(jī)理是復(fù)雜的，還沒有完全為人所知。其作用可能為刺激吞噬作用及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)的活性，同時(shí)延遲抗體的釋放及抗體的降解。佐劑的例子有如下這些，F(xiàn)reund′s佐劑（完全或不完全），佐劑65（含花生油，二縮甘露醇-油酸脂及硬脂酸鋁），普魯蘭尼克多醇化合物L(fēng)-121，Avridine，及氫氧化鋁或磷酸鋁或者明礬等的無機(jī)物凝膠。Freund′s佐劑已經(jīng)不再使用了，因其含有非生化代謝礦物油而成為一種潛在的致癌物。

用于生產(chǎn)亞單位免疫的重組DNA技術(shù)包括分子克隆及克隆的病毒基因在合適的宿主中表達(dá)并獲得在宿中動(dòng)物體內(nèi)能引起免疫中和應(yīng)答的蛋白質(zhì)。并且排除了其他的非表達(dá)上述特定的蛋白質(zhì)的任何遺傳信息。宿主沒有受完全病毒的影響因?yàn)闆]有感染的危險(xiǎn)性。

最近，有人提出一種對(duì)于制備亞單位疫苗很有用處的方法。（Mackett，M.，Smith，G.L.andMoss，B.，1982，ProcNatl.Acad.Sci79∶7415-7419;Mackett，M.，Smith，G.L.andMoss，B.，1984，J.Virol.49∶857-864;Panicali，D.andPaoletti，E.，1982，Proc.Nat′l.Acad.Sci.79∶4927-4931）。此方法包括應(yīng)用牛痘病毒作為載體，將外來的基因插入其染色體，并使之表達(dá)特定的蛋白質(zhì)。重組的牛痘病毒插入外來基因后導(dǎo)入宿主動(dòng)物，使宿主對(duì)于重組基因表達(dá)的產(chǎn)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答。因?yàn)榛畹闹亟M牛痘病毒可以用作疫苗，故而此方法具備了亞單位疫苗和活疫苗的共同優(yōu)點(diǎn)。

牛痘病毒包含一條線性的反鏈DNA染色體，具有大約187千對(duì)堿基對(duì)并在被感染的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制。在這些病毒的核芯中包含一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)（包括帽子形成，甲基化和聚腺嘌呤酶）。這些系統(tǒng)是引起病毒感染所必須的。當(dāng)這些病毒失去了核之后就喪失了感染能力。牛痘病毒的轉(zhuǎn)錄控制順序（啟動(dòng)子）可以被牛痘的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)但不能被宿主細(xì)胞的RNA聚合酶啟動(dòng)。

只有當(dāng)牛痘啟動(dòng)子被結(jié)合在外來基因的蛋白克隆DNA序列時(shí)，重組牛痘病毒的外來DNA才能表達(dá)。質(zhì)粒載體亦稱為插入載體，插入基因進(jìn)行組建后再轉(zhuǎn)入牛痘病毒。

一種類型的插入載體是由以下各部分組成的，（a）一個(gè)含有轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的牛痘病毒的啟動(dòng)子;（b）幾種獨(dú)特的位于轉(zhuǎn)錄開始位點(diǎn)的下游的限制性核酸內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)，以插入外源DNA碎片。（c）位于啟動(dòng)子及克隆位點(diǎn)側(cè)面的非必需牛痘病毒DNA，（如TK基因），可以引導(dǎo)基因插入病毒的染色體，（d）一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起始點(diǎn)和在大腸桿菌中的復(fù)制與選擇的耐抗菌素抵抗性標(biāo)記。Mackett對(duì)此類的載體例子作了敘述。（Mackett，M.，Smith，G.L.andMoss，B.，1984，J.Virol.49∶857-864）。

重組牛痘病毒通過將含有外源基因的重組細(xì)菌插入質(zhì)粒加入預(yù)先被牛痘病毒感染的細(xì)胞，經(jīng)過轉(zhuǎn)染作用而得到。在被感染的細(xì)胞中發(fā)生同源重組而使得外源性基因插入病毒染色體。被感染的細(xì)胞可通過免疫技術(shù)，DNA空斑雜化或隨后可以分離的重組病毒基因的選擇來篩出。這些牛痘重組體保留了它們的基本功能及感染力并可以容納大約35千個(gè)堿基的外源DNA。外源基因的表達(dá)可以通過酶法或免疫測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定（如免疫沉淀法，放射免疫測(cè)定法或免疫吸附法）經(jīng)重組牛痘感染的細(xì)胞合成的蛋白是經(jīng)過糖化的，并且被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面形成膜糖蛋白。可以通過使用強(qiáng)啟動(dòng)子的方法或?qū)σ粋€(gè)單獨(dú)的基因進(jìn)行多考貝克隆的方法，得到較高程度的表達(dá)。

最近有人提出一種方法，對(duì)于重組蛋白的制備具有很大意義。（Pennocketal.，1984，Mol.cellBiol.4∶399;Smithetal.，1983，J.Virol.46∶584）該方法使用桿狀病毒載體來表達(dá)插入其染色體的外源基因。當(dāng)該桿狀病毒重組體導(dǎo)入適合的宿主細(xì)胞后，便可表達(dá)其外源基因。

桿狀病毒的原始型為Autofraphacalifornica核多面體病毒（AcNPV）。AcNPV染色體包括一個(gè)含128千對(duì)堿基的雙鏈環(huán)狀DNA，該染色體的基因圖有若干個(gè)限制位點(diǎn)（Smith，G.E.andSummers，M.D.，1978，Virology89∶517）病毒在被感染的細(xì)胞的核內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。野生型AcNPV感染細(xì)胞后產(chǎn)生兩種病毒形態(tài)即閉塞或非閉塞病毒顆粒。閉塞的病毒顆粒被一種叫做多面體的蛋白包裹，該多面體蛋白是由多面體基因編碼的。（參閱Virol.131∶561-565，1983）.非閉塞的病毒顆粒通過光學(xué)顯微鏡可以很容易地從感染細(xì)胞中觀察到。當(dāng)重組桿狀病毒的啟動(dòng)子結(jié)合到外源基因的編碼蛋白的DNA序列后，該重組桿狀病毒的外源DNA才能被表達(dá)。質(zhì)粒載體亦稱為插入載體，嵌入基因而被組建，然后組建了的質(zhì)粒再將嵌入基因插入AcNPV。一種類型的插入載體是由以下各部分組成的，（a）一個(gè)含有轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的AcNPV啟動(dòng)子（b）幾種獨(dú)特的位于轉(zhuǎn)錄開始位點(diǎn)下游的限制核酸內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)，以插入外源DNA碎片。（c）位于啟動(dòng)子及克隆位點(diǎn)側(cè)面的非必需AcNPVDNA（如多面體基因）可以引導(dǎo)基因插入病毒的染色體。（d）一個(gè)細(xì)菌復(fù)制原點(diǎn)和在大腸桿菌中的復(fù)制與選擇的耐抗菌素標(biāo)記。Miyamota等人對(duì)此類載體的例子作了敘述。（1985，Mol.Cell.Biol.5∶2860）。

重組桿狀病毒可以通過將插入了外源基因的重組細(xì)菌質(zhì)粒與桿狀病毒DNA共同轉(zhuǎn)源入細(xì)胞中而獲得。在被感染的細(xì)胞中發(fā)生同源重組并使外源基因能插入病毒染色體。一旦外源基因插入了多面體基因，就不能再產(chǎn)生閉塞病毒顆粒，因而可以通過觀察由于缺乏閉塞體而產(chǎn)生的空斑的辦法把重組空斑篩選出來。被感染的細(xì)胞也可通過免疫學(xué)技術(shù)，DNA空斑雜化或重組病毒的基因選擇的方法來篩選。重組病毒隨后可以被分離。桿狀病毒的重組體保留了它們基本的功能及感染能力。

外源基因的表達(dá)可以通過酶法或免疫測(cè)定來檢測(cè)（例如免疫沉淀法，放射免疫測(cè)定法，或免疫斑點(diǎn)法）通過使用強(qiáng)啟動(dòng)子或?qū)蝹€(gè)基因的多考貝克隆方法，可以提高表達(dá)的程度。

指導(dǎo)與LAV/HTLVⅢ抗原表位有關(guān)的肽或蛋白表達(dá)的病毒已被敘述。本發(fā)明表達(dá)與LAV/HTLVⅢ有關(guān)的能誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的抗原表位的重組病毒，可被制成病毒疫苗配方，用來保護(hù)人們抵抗LAV/HTLVⅢ的感染。本發(fā)明的實(shí)施例中，用在宿主中不致病但在被感染的宿主中能表達(dá)與LAV/HTLVⅢ有關(guān)的抗原表位的具有感染性的病毒，可用以活的病毒疫苗的配方。

本發(fā)明也涉及與LAV/HTLVⅢ的抗原表位有關(guān)肽或蛋白質(zhì)。那此誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)免疫應(yīng)答的物質(zhì)可被用在亞單位疫苗或者多價(jià)疫苗來保護(hù)人們以防LAV/HTLVⅢ的感染。另外，本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)可用於AIDS或LAS的診斷檢測(cè)。本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)可在任何宿主細(xì)胞表達(dá)載體系統(tǒng)中產(chǎn)生并可被分離出來。這些包括，如被合適的重組病毒感染的動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞;被重組質(zhì)粒，柯斯質(zhì)?；蚴删w轉(zhuǎn)染的細(xì)菌類的微生物，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的酵母。本發(fā)明同時(shí)提供方法，工藝和被用來表達(dá)編碼LAV/HTLVⅢ抗原表位基因信息的DNA的組建。另外，本發(fā)明所涉及的多肽和蛋白質(zhì)能被化學(xué)法合成。

本發(fā)明的實(shí)施例中（詳見實(shí)施例）編碼LAV/HTLVⅢ外殼糖蛋白或核芯結(jié)構(gòu)蛋白的基因順序（就是LAV/HTLVⅢ的env或gag基因順序）被插入質(zhì)粒中以使牛痘病毒啟動(dòng)子位于LAV/HTLVⅢ基因順序的起始蛋氨酸順列（ATG）與5′位，使插入基因的組建位于牛痘胸腺嘧啶核苷激酶（TK）DNA序列的旁側(cè)。這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至預(yù)先用野生型牛痘病毒嚴(yán)重感染的細(xì)胞中去，這樣，允許位于TK順序旁側(cè)的插入的LAV/HTLVⅢenv或gag基因被重組到牛痘病毒的TK基因中去。這些細(xì)胞被溶解而導(dǎo)致病毒在TK-細(xì)胞上形成空斑。重組病毒在5-溴脫氧尿嘧啶存在下通過它們?cè)谶@些細(xì)胞上形成空斑能力進(jìn)行選擇也可以通過對(duì)于組成LAV/HTLVⅢ外殼或LAV/HTLVⅢgag序列進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆派湫詷?biāo)記的探針進(jìn)行DNA-DNA雜交。正雜交空斑已被純化擴(kuò)大，從而重組病毒被用來測(cè)定它們產(chǎn)生LAV/HTLVⅢ外殼糖蛋白或核心結(jié)構(gòu)蛋白的能力。通過重組牛痘病毒表達(dá)的與LAV/HTLVⅢ外殼相關(guān)的蛋白質(zhì)證明具有抗原性和免疫原性，并具有亞人類靈長目動(dòng)物中引起體液和細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫的能力。由重組牛痘病毒產(chǎn)生的與LAV/HTLVⅢgag有關(guān)的蛋白質(zhì)是含有真正核心蛋白主要抗原表位的具有免疫反應(yīng)性的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的另一實(shí)施例中，LAV/HTLVⅢenv或gag順序被插入質(zhì)粒中去以便桿狀病毒多面體啟動(dòng)子可位于3′端多面體DNA后LAV/HTLVⅢ基因的起始蛋氨酸順序（ATG）的5′位置。這些質(zhì)粒與野生型桿狀DNA一起共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中去，使得插入的LAV/HTLVⅢ基因位于被重組到桿狀病毒多面體基因中去的另外的AcNPV順序的旁側(cè)。細(xì)胞被溶解而形成病毒空斑，由于沒有外殼的重組病毒，可用目測(cè)篩選或用帶輻射標(biāo)志的LAV/HTLVⅢenv或LAV/HTLVⅢgag探針篩選進(jìn)行DNA-DNA雜交篩選。重組空斑已被純化和擴(kuò)大，產(chǎn)生的重組病毒通過產(chǎn)生LAV/HTLVⅢ相關(guān)蛋白能力的免疫沉淀法及SDS聚丙烯酰胺凝膠分析的方法將重組病毒篩選出來。被感染的細(xì)胞溶解物經(jīng)測(cè)定具有在血清中用ELISA法檢測(cè)LAV/HTLVⅢ抗體的能力。

附圖說明

圖1表示完整的LAV/HTLVⅢ的前病毒染色體結(jié)構(gòu)。畫陰影線部分為開放的閱讀框。此區(qū)域編碼組專一性的抗原，逆轉(zhuǎn)錄酶及外殼蛋白，分別由gag，pol及env代表。交叉陰影線部分代表重疊開放閱讀框。圖上的數(shù)字表達(dá)自作為病毒轉(zhuǎn)錄開始點(diǎn)的帽子位點(diǎn)數(shù)起下游的堿基對(duì)數(shù)目。限制性位點(diǎn)為用Bg，BglⅡ;Ec，EcoRⅠ;Hn，HindⅢ;Kp，KpnⅠ;Ss，SstⅠ來標(biāo)記。

圖2表示在質(zhì)粒pRS-3DNA中的LAV/HTLVⅢ專一性區(qū)域（EcoRT至Sstl）的核苷酸程序，完整的LAV/HTLVⅢ外殼基因（核甘酸5766至8349）包含在LAV/HTLVⅢ的插入部分中。用于PV-env1，PV-env2及PV-env5的結(jié)構(gòu)的限制性位點(diǎn)被指明。同時(shí)還指明了由核苷酸順序數(shù)據(jù)推測(cè)的完整的外殼基因氨基酸順序。

圖3用圖解表示包含有一份LAV/HTLVⅢ外殼蛋白編碼順序的質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，該外殼蛋白編碼順序接在一個(gè)牛痘病毒啟動(dòng)子的下游。LAV/HTLVⅢ外殼編碼序列用方框表示，牛痘啟動(dòng)子用暗色的方框表示。圖的下方表示牛痘啟動(dòng)子區(qū)域與LAV/HTLVⅢ外殼編碼順序的連接部分的核苷酸順序。劃線部分代表假定的插入基因的起始密碼子及閱讀框。注意在重組PV-env2的翻譯順序（Pro-Val）中的第三及四氨基酸是與LAV/HTLVⅢ外殼編碼序列的第四十三及四十四個(gè)氨基酸相對(duì)應(yīng)的。

圖4用圖解表示被插入在一牛痘病毒啟動(dòng)子下游的含有完整的LAV/HTLVⅢ外殼蛋白編碼順序的質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。牛痘病毒啟動(dòng)子用暗色的方框表示。含有完整的LAV/HTLVⅢ外殼編碼區(qū)域的質(zhì)粒PV-env5是分兩個(gè)步驟組建的。編碼區(qū)域的5′和3′部份最先分別被克隆至pGS20中形成包含有LAV/HTLVⅢ外殼基因的氨基編碼終端的PV-env1和包含LAV/HTLVⅢ外殼基因的羧基編碼終端的PV-env2。如圖所示，這兩部份在StuⅠ部位重新結(jié)合。

圖5圖解表示缺乏轉(zhuǎn)換膜順序的被插入在一個(gè)牛痘病毒啟動(dòng)子下游的，包含有LAV/HTLVⅢ外殼蛋白編碼序列的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。質(zhì)粒PV-env7分兩步組建。PV-env5的5′部份被插入到P26中形成一個(gè)中間質(zhì)粒-PV-env5/26，該中間質(zhì)粒提供一個(gè)可裝配的翻譯終止順序（TAA）形成一個(gè)截短的env基因。然后用TAA終止的截短的env順序插入到PG20以組建PV-env7，其中牛痘TK基因順序位于截短的env基因的側(cè)面。

圖6表示牛痘病毒重組體的結(jié)構(gòu)及選擇。實(shí)線表示牛痘病毒的胸腺嘧啶激酶（TK）基因。此TK基因也存在于質(zhì)粒PV-env5DNA中，但是在質(zhì)粒中TK基因被包含有牛痘7.5K啟動(dòng)子（暗色方框）和LAV/HTLVⅢ外殼編碼區(qū)域（空白方框）的插入基因打斷。當(dāng)細(xì)胞被牛痘感染后，含有被LAV/HTLVⅢ外殼基因打斷的TK基因的重組質(zhì)粒被導(dǎo)入到感染了的細(xì)胞。於是在位于插入基因側(cè)面的TK順序發(fā)生了重組而將LAV/HTLVⅢ外殼基因?qū)肱６徊《救旧w。重組產(chǎn)生的含LAV/HTLVⅢ外殼基因的病毒是TK-的。

圖7表示含有LAV/HTLVⅢenv基因重組牛痘病毒的染色體結(jié)構(gòu)的特征。

圖7A表示牛痘重組體V-env5和V-env5NY及其相關(guān)親本牛痘株（WR及V-NY）的限制性酶分析。由限制性酶HindⅢ水解產(chǎn)生的DNA碎片在瓊脂糖凝膠電池中被分離，經(jīng)溴乙錠染色后顯示出色帶。

圖7B表示通過將分離出來的限制性片段轉(zhuǎn)移到硝化纖維素并與對(duì)LAV/HTLVⅢ外殼順序有專一性的探查物雜化后得到的Southern斑點(diǎn)。

圖8A表示對(duì)由牛痘-LAV/HTLVⅢ重組體表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行的Western免疫點(diǎn)斑分析。下述來源的蛋白質(zhì)在7-15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行梯度電泳電轉(zhuǎn)移至硝化纖維素片上：LAV/HTLVⅢ病毒蛋白（LAV/HTLVⅢ）;野生型牛痘病毒感染的細(xì)胞（WTvv）;未感染細(xì)胞（mock）;被重組病毒V-env2（V-env2），或V-env5（V-env5）感染的細(xì)胞。蛋白質(zhì)對(duì)于AIDS病人血清的免疫反應(yīng)性可以通過把過氧化物酶加入抗人類TgG抗體的辦法進(jìn)行檢測(cè)。gp150，gp110和gp41表示LAV/HTLVⅢenv基因的產(chǎn)物。分子量用千道爾頓表示。

圖8B表示在兩種細(xì)胞中由牛痘-LAV/HTLVⅢenv重組體表達(dá)的蛋白質(zhì)的Wertern免疫斑點(diǎn)分析。從BSC-40或Hela細(xì)胞中衍生的蛋白質(zhì)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電脈（SDS-PAGE）分離并且電轉(zhuǎn)移至硝化纖維片上并與LAV/HTLVⅢ血清反應(yīng)陽性個(gè)體的集合血清進(jìn)行反應(yīng)。

欄1和5表示模擬感染的細(xì)胞;欄2和6野生型牛痘病毒感染的細(xì)胞;欄3和7表示由V-env5感染的細(xì)胞，欄4和8表示由V-env2感染的細(xì)胞。gp150，gp110和gp41表示LAV/HTLVⅢ-env基因產(chǎn)物。用標(biāo)記為125Ⅰ的蛋白A來測(cè)定免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)。

圖9A表示用野生牛痘病毒（WTvv）或者重組牛痘病毒（V-env2和V-env5）感染的細(xì)胞所表達(dá)的蛋白放射免疫沉淀分析的結(jié)果。蛋白質(zhì)在感染10-12小時(shí)后用35S-蛋氨酸標(biāo)記。細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中標(biāo)記蛋白與對(duì)照的人體血清（N）或AIDS病人血清（Ⅰ）反應(yīng)，免疫復(fù)合物被金黃色葡萄球菌（Slaphylococcusaureus）蛋白A沉淀。免疫沉淀的蛋白在15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離，并且用熒光照相來檢測(cè)。分子量用千道爾頓表示。

圖9B表示對(duì)于用本發(fā)明的牛痘-LAV/HTLVⅢ重組體所表達(dá)的以3H-氨基葡糖標(biāo)記的蛋白質(zhì)，進(jìn)行放射免疫沉淀分析的結(jié)果。Hela細(xì)胞無論是被模擬感染（欄1及5），或被野生型的牛痘病毒感染（欄2及6）或被V-env5（欄3及7）或V-env2（欄4及8）感染的都用3H-氨基葡糖標(biāo)記。通過加入正常人體血清（欄1-4或LAV/HTLVⅢ血清反應(yīng)陽性的個(gè)體的集合血清（欄5-8）及蛋白A使得細(xì)胞溶胞物發(fā)生免疫沉淀。免疫沉淀蛋白再用SDS-PAGE拆分。

圖9C表示用“脈沖追蹤”放射免疫沉淀法對(duì)于由牛痘-LAV/HTLVⅢ重組體表達(dá)的LAV/HTLVⅢ外殼蛋白的分析結(jié)果。Hela細(xì)胞用野生型牛痘病毒V-env5或V-env2感染，35S蛋氨酸標(biāo)記，并用追蹤介質(zhì)基清洗。在下述時(shí)間間隔內(nèi)，細(xì)胞被洗凈，溶解，與LAV/HTLVⅢ血清反應(yīng)陽性個(gè)體的集合血清發(fā)生免疫沉淀，及用SDS-PAGE分離：0小時(shí)（欄1，7，13）;0.5小時(shí)（欄2，8，14）;1小時(shí)（欄3，9，15）;2小時(shí)（欄4，10，16）;6小時(shí)（欄5，11，17）及12小時(shí)（欄6，12，18）。欄M提供包括C14標(biāo)記的分子量標(biāo)準(zhǔn)。

圖9D提供對(duì)被本發(fā)明的重組牛痘-LAV/HTLVⅢ病毒感染的細(xì)胞及介質(zhì)中提出的與LAV/HTLVⅢ外殼相關(guān)的蛋白進(jìn)行的放射免疫沉淀分析結(jié)果。Hela細(xì)胞不論被模擬感染（欄1），或野生型牛痘病毒（欄2），V-env5（欄3）或V-env2（欄4）感染，都用35S蛋氨酸來標(biāo)記。細(xì)胞被從介質(zhì)中分離并且溶破。每個(gè)細(xì)胞溶胞物（Pellet）及介質(zhì)（Supe）加入LAV/HTLVⅢ血清反應(yīng)陽性個(gè)體的集合血清使之發(fā)生免疫沉淀。免疫沉淀蛋白用SDS-PAGE拆分。

圖9E提供對(duì)于被本發(fā)明的重組牛痘-LAV/HTLVⅢ病毒感染的細(xì)胞及介質(zhì)中的與LAV/HTLVⅢ外殼相關(guān)的蛋白進(jìn)行的放射免疫沉淀分析結(jié)果。重組V-env包括完整的LAV/HTLVⅢ外殼編碼順序，而V-env7包含的LAV/HTLVⅢ外殼編碼順序缺乏跨膜（anchor）區(qū)域。Hela細(xì)胞不論被模擬感染（欄1），或被野生型牛痘病毒（欄2），V-env5（欄3）或V-env2（欄4）感染，都用35S蛋氨酸來標(biāo)記。細(xì)胞被從培養(yǎng)基中提出并且溶破。細(xì)胞溶胞物（Pellet）及介質(zhì)（上清液）加入LAV/HTLVⅢ血清反應(yīng)陽性個(gè)體的集合血清使之發(fā)生免疫沉淀。免疫沉淀蛋白用SDS-PAGE拆分。

圖10，提供對(duì)于經(jīng)重組牛痘-LAV/HTLVⅢ病毒免疫的鼠的血清樣品進(jìn)行的Western斑點(diǎn)反應(yīng)分析。鼠被V-env5或V-env2重組牛痘病毒免疫。8個(gè)星期后，用被SDS-PAGE分析并已電轉(zhuǎn)移至硝化纖維素片上的LAV/HTLVⅢ病毒蛋白與血清樣品反應(yīng)。將山羊的抗鼠免疫球蛋白結(jié)合到堿性的磷酸脂酶中，用以測(cè)定那些能被鼠血清識(shí)別的LAV/HTLVⅢ蛋白。欄a至e提供從五個(gè)接種了V-enV5的個(gè)體鼠取出的血清樣品，而欄f至k則提供從五個(gè)接種了V-enV2的個(gè)體鼠的血清樣品。從對(duì)LAV/HTLVⅢ血清反應(yīng)陽性個(gè)體（AIDS）和非免疫的C57B16J鼠（NMS）得到的集合血清被分到用作正和負(fù)的對(duì)照。LAV/HTLVⅢ外殼糖蛋白gp150，gp110及gp41的部位已被指出。

圖11，提供接種了重組牛痘病毒V-env5的彌猴的血清轉(zhuǎn)化的直方圖。四只猴子用皮膚劃破法接種2×108pfu的V-env5另四只則接種2×107pfu的V-env5。一只動(dòng)物被接種2×107的pfu的對(duì)照牛痘皰疹的單純的gD重組體（V-HSVgD1）。第一次接種十個(gè)星期之后，除動(dòng)物NO.81之外，給于所有動(dòng)物用第二次2×108pfu的同一病毒的接種。采集接種前（空白方框）;初次接種后四星期（陰影線方框）;和第二次接種后四星期（實(shí)心方框）的血清樣品。通過ELISA采用提純的LAV/HTLVⅢ病毒作為靶抗原的方法來測(cè)定血清轉(zhuǎn)化。

圖12提供一個(gè)對(duì)于如上圖11描述的經(jīng)牛痘-LAV/HTLVⅢ重組病毒，V-env5免疫的彌猴血清樣品進(jìn)行的Western免疫斑點(diǎn)分析。采集初次接種前（欄pre）和第二次接種四星期后血清樣品。血清被稀釋五十倍后與LAV/HTLVⅢ病毒粒子蛋白反應(yīng)，該病毒粒子蛋白經(jīng)SDS-PAGE拆分并通過電轉(zhuǎn)移固定于硝化纖維素濾片上，電轉(zhuǎn)移用一種所最有效測(cè)定兩種外殼糖蛋白gp110（圖12A）及gp41（圖12B）的方法。被彌猴血清識(shí)別的LAV/HTLVⅢ蛋白通過將山羊抗一人類免疫球蛋白與堿性磷酸酯酶結(jié)合的方法來測(cè)定。來自LAV/HTLVⅢ血清反應(yīng)陽性個(gè)體（AIDS）的集合血清用于正對(duì)照。真正的LAV/HTLVⅢ病毒粒子（AIDS）作為一種對(duì)照使用。

圖13描述了被牛痘NY-LAV/HTLVⅢ重組病毒，V-env5NY免疫的黑猩猩血清樣品的Western免疫斑點(diǎn)分析。兩個(gè)黑猩猩用5×108pfu的V-env5NY進(jìn)行皮下注射，同時(shí)另一個(gè)動(dòng)物用同樣劑量的V-HSVgD1NY注射，從同源牛痘-NY中組建了牛痘泡疹單一病毒gD重組體。在初次注射后八周內(nèi)所有動(dòng)物進(jìn)行了第二次注射。收集了免疫前的血清樣品（欄1），初次免疫后的八周（欄2）和第二次免疫后的二周（欄3）的血清液樣品。血清稀釋五十倍后取出部份與通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳而被拆分和經(jīng)電轉(zhuǎn)移固定在硝化纖維素濾片上的LAV/HTLVⅢ病毒顆粒蛋白反應(yīng)，采用最佳的gp41檢測(cè)方案。LAV/HTLVⅢ的蛋白質(zhì)通過與堿性磷酸酯酶相連的羊抗人體免疫球蛋白的黑猩猩血清測(cè)定的方法得到識(shí)別。收集LAV/HTLVⅢ血清反應(yīng)陽性個(gè)體的血清作為正對(duì)照品。

圖14描述了在質(zhì)粒pKS-5DNA中出現(xiàn)的LAV/HTLVⅢ專一區(qū)域（SstⅠ至KpnⅠ）的核苷酸順序，整個(gè)LAV/HTLVⅢgag基因（核苷酸340至1835）包括在LAV/HTLVⅢ插入物中。用于pAC-gag1組建的限制性位點(diǎn)已被標(biāo)出。從gag基因中核苷酸順序的數(shù)據(jù)可推論出的整個(gè)氨基酸順序也被闡明。

圖15是包含整個(gè)插入AcNPV啟動(dòng)子下游的LAV/HTLVⅢgag蛋白質(zhì)密碼順序的質(zhì)粒pAC-gag1組建圖解。pAC610克隆載體同時(shí)包含一個(gè)與多面體基因啟動(dòng)子對(duì)應(yīng)的核苷酸順序，并含有5′前導(dǎo)順序和被位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游部位的克隆位點(diǎn)打斷的3′多面體順序。位于-8位置的克隆位點(diǎn)是：EcoRⅠ，SstⅠ，SmaⅠ（Xmal），BamHⅠ，XbaⅠ和PstⅠ。SalⅠ，AccⅠ和HincⅡ不是單個(gè)。沒有KpnⅠ或BglⅡ位點(diǎn)。

圖16描述了重組AcNPV（Ac-gag1）的組建和篩選。帶陰影的方框表示多面體啟動(dòng)子和5′前導(dǎo)順序。實(shí)心方框表示桿狀病毒的多面體基因。部分基因存在于質(zhì)粒pAc-gag1DNA中，被LAV/HTLVⅢgag密碼區(qū)（空心方框）阻斷。包含被LAV/HTLVⅢgag基因（pAc-gag1）打斷的多面體基因的一部分和野生型AcNPVDNA共同傳染細(xì)胞。發(fā)生在插入基因旁位側(cè)的多面體順序的重組體將LAV/HTLVⅢgag基因順序?qū)階cNPV染色體中。

圖17描述了從被野生型AcPNY和使用LAV/HTLVⅢgag的特殊探針的Ac-gag1感染的Spodopterafrugiperda細(xì)胞提取的RNA的northern斑點(diǎn)分析。

圖18描述了在被重組的桿狀病毒Ac-gag1感染的細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)的一種放射免疫沉淀分析的結(jié)果。分別在感染后24小時(shí)（欄1，2），48小時(shí)（欄3，4）及72小時(shí)（欄5，6）時(shí)用[35S]蛋氨酸標(biāo)志蛋白質(zhì)2小時(shí)。細(xì)胞胞溶物中的標(biāo)記蛋白質(zhì)與作對(duì)照用的人體血清（欄1，3，5）或AIDS病人血清（欄2，4，6）進(jìn)行反應(yīng)，并用金黃色葡萄球菌（slaphylococcusaureus）蛋白A使免疫復(fù)合物發(fā)生沉淀。免疫沉淀的蛋白用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，可用熒火照相法進(jìn)行測(cè)定。分子量單位為千道爾頓計(jì)算。

圖19提供對(duì)于LAV/HTLVⅢ基因相關(guān)的蛋白質(zhì)的“脈沖跟蹤”放射免疫沉淀分析結(jié)果。該LAV/HTLVⅢ基因相關(guān)蛋白質(zhì)取自于經(jīng)本發(fā)明重組AcNPV感染的細(xì)胞。spodopterafrugiperda（sf9）細(xì)胞被Ac-gag1感染并在感染后24小時(shí)用脈沖標(biāo)記法標(biāo)記5分鐘。然后細(xì)胞用完全培養(yǎng)基洗滌并用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)0小時(shí)（欄1，2）培養(yǎng)2小時(shí)（欄3，4），4小時(shí)（欄5，6）及8小時(shí)（欄7，8）。在這些期間內(nèi)，細(xì)胞分別經(jīng)歷洗滌，溶胞及與LAV/HTLVⅢ血清反應(yīng)陽性個(gè)體（欄2，4，6，8）的集合的血清或正常人體血清（欄1，3，5，7）進(jìn)行免疫沉淀過程。蛋白質(zhì)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳過程拆分。

圖20圖示五種包括與含有g(shù)ag編碼順序的各種長度的LAV/HTLVⅢ染色體結(jié)扎在牛痘病毒7.5K啟動(dòng)子的質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，這五種質(zhì)粒為PV-gag1，PV-gag2，PV-gag3，PV-gag4及PV-gag5。在這些結(jié)構(gòu)中使用的pGS62克隆載體與pGS20基本相似（參見圖3），所不同的是pGS20在其特別的SmaⅠ位下游具有一個(gè)獨(dú)特的EcoRⅠ位點(diǎn)。

圖21表示對(duì)于各被重組牛痘LAV/HTLVⅢ病毒（V-gag1NY，V-gag2NY，V_gag3NY，V_gag4NY及V_gag5NY），親本牛痘病毒（V_NY）及模擬（mock）感染細(xì)胞模擬（mock）感染的細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的蛋白質(zhì)的Western斑點(diǎn)（blot）分析的結(jié)果。純化的LAV/HTLVⅢ病毒粒子（LAV/HTLVⅢ）樣品可以作為正對(duì)照物。匯合的BSC-40細(xì)胞有十分之一被感染。感染可以持續(xù)12小時(shí)，在此期間收集細(xì)胞再行溶破。所有細(xì)胞的蛋白被SDS-PAGE分離，通過電轉(zhuǎn)移固定在硝化纖維素上。濾片可與下述物質(zhì)反應(yīng)：

（1）AIDS病人血清（圖21B）可以用結(jié)合了堿性磷酸酯酶的山羊抗人免疫球蛋白對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。

（2）針對(duì)已經(jīng)確定為gag蛋白p25及p18的鼠單克隆抗體（圖21A及21C）可以用結(jié)合于堿性磷酸酯酶的山羊抗鼠免疫球蛋白對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。

圖22表示質(zhì)粒pAC-env5的結(jié)構(gòu)，該質(zhì)粒包含有插在AcNPV多面體啟動(dòng)子下游的完整的LAV/HTLVⅢ外殼的編碼順序。在前的圖15表示PAC610克隆載體。

圖23表示用放射免疫沉淀法對(duì)于在感染了重組桿狀病毒Ac-env5的細(xì)胞中所表達(dá)的蛋白進(jìn)行的分析結(jié)果。模擬感染的細(xì)胞（mock）和親本桿狀病毒株（AcNPV）列入圖中作為對(duì)照。對(duì)被感染的sf9細(xì)胞所表達(dá)的蛋白，在感染28小時(shí)之后用35S蛋氨酸標(biāo)記2小時(shí)。細(xì)胞的胞溶物中的標(biāo)記蛋白與AIDS病人血清或針對(duì)gp110或gp41的鼠單克隆抗體反應(yīng)，用金黃色葡萄球菌（slaphylococcusaureus）蛋白A使免疫復(fù)合物沉淀。免疫沉淀蛋白用SDS-PAGE分離并用熒光照相法檢測(cè)。

5.發(fā)明細(xì)述

本發(fā)明針對(duì)于產(chǎn)生與LAV/HTLVⅢ抗原表位有關(guān)的肽或蛋白的病毒。同時(shí)也針對(duì)于可以采用DNA重組法或化學(xué)合成法制取的這些肽或蛋白。本發(fā)明中的這些可能引起防御性免疫應(yīng)答的病毒或肽、蛋白，可以用作各種疫苗配方中的免疫原，以防止LAS及AIDS病的病原物質(zhì)LAV/HTLVⅢ的感染。另外，本發(fā)明涉及的肽或蛋白可用作免疫學(xué)診斷分析法中抗原來以檢測(cè)病人體內(nèi)LAV/HTLV的特異性抗體。本發(fā)明免疫學(xué)方法所用的肽或蛋白應(yīng)具有抗原性（即能與患者LAV/HTLV抗體反應(yīng)），但毋須具備免疫原性（即能引起免疫應(yīng)答）此外，免疫學(xué)診斷中的抗原也不必在體內(nèi)引起防御性免疫應(yīng)答反應(yīng)。

本發(fā)明中一個(gè)實(shí)施例是使用了DNA重組技術(shù)，將編碼LAV/HTLVⅢ抗原表位的核苷酸順序插入到表達(dá)載體中，這種載體在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中指導(dǎo)LAV/HTLVⅢ順序的表達(dá)。這些表達(dá)載體一宿主細(xì)胞系統(tǒng)可用于體外制取與LAV/HTLVⅢ有關(guān)的多肽或蛋白，這樣，基因產(chǎn)物就能從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化出來。能引起防御性免疫應(yīng)答的肽或蛋白可作為疫苗亞單位配方分中的免疫原。再者，本發(fā)明中有免疫原性或僅有抗原性的肽和蛋白就可以用作免疫診斷分析中的抗原，來檢測(cè)病人體內(nèi)LAV/HTLVⅢ的特異性抗體。本發(fā)明中關(guān)于肽和蛋白制取的另一層意義在于：通過表達(dá)抗原性和/或免疫原性的LAV/HTLVⅢ相關(guān)肽和蛋白的重組體內(nèi)包含的核苷酸順序，從而可以推斷出肽和蛋白產(chǎn)物的氨基酸順序。這些肽和蛋白可用化學(xué)法合成，并用于亞單位疫苗配方中（如果有免疫原性），或用作免疫診斷中的抗原（如果具抗原性和/或免疫原性）。當(dāng)病毒作為表達(dá)載體，指導(dǎo)表達(dá)與能引起防御性免疫反應(yīng)的LAV/HTLVⅢ抗原表位基有關(guān)的免疫原時(shí)，病毒本身便可構(gòu)成疫苗。對(duì)宿主不致病的感染性重組體病毒可以用于制備提供實(shí)體免疫的活疫苗?；蛘撸ㄟ^“殺死”病毒可制備滅活的病毒疫苗。此外，還可以制備含兩個(gè)或兩個(gè)以上LAV/HTLVⅢ抗原決定基的多價(jià)疫苗，或都是一個(gè)LAV/HTLVⅢ抗原表位，以及其他致病物的抗原表位都可制備。

只是出于敘述方便，本發(fā)明的方法可分為以下幾個(gè)階段：（a）編碼LAV/HTLVⅢ病毒蛋白的基因或基因碎片的分離。（b）將基因或基因碎片插入表達(dá)載體。（c）識(shí)別以及表達(dá)載體在宿主中復(fù)制，表達(dá)基因能在宿主系統(tǒng)中的復(fù)制生長。（d）基因產(chǎn)物的鑒定和純化（e）產(chǎn)物免疫能力的測(cè)定。（f）疫苗的配方組分。

發(fā)明實(shí)施例中描述了重組疫苗病毒桿狀病毒的結(jié)構(gòu)，這些病毒含有LAV/HTLVⅢ外殼基因，在被重組病毒感染的組織培養(yǎng)細(xì)胞中指導(dǎo)與LAV/HTLVⅢ外殼蛋白免疫相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)。另外，發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中描述了重組牛痘病毒的結(jié)構(gòu)和含LAV/HTLVⅢgag基因的重組疫苗病毒和桿狀病毒的結(jié)構(gòu)。其中的gag基因指導(dǎo)著受重組病毒感染的組織培養(yǎng)細(xì)胞中與核結(jié)構(gòu)蛋白免疫相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)。然而此處描述的組成，方法并不僅限于表達(dá)LAV/HTLVⅢ外殼或gag基因相關(guān)的蛋白的重組病毒結(jié)構(gòu)，還可用于任何表達(dá)載體系統(tǒng)重組體的組建，來產(chǎn)生與AIDS病任何致病物抗原有關(guān)的多肽。

為清晰起見，整個(gè)方法將從LAV/HTLVⅢ外殼及gag基因兩方面討論。同樣的技術(shù)也可用于類似的模式來組建表達(dá)載體，產(chǎn)生與任何LAV/HTLVⅢ蛋白相關(guān)的多肽，以及有關(guān)病毒的多肽。這些蛋白包括但并不僅限于LAV/HTLVⅢ基因產(chǎn)物，如gag，pol和evn基因，以及至少四種至今稱為sor，tat，3′-orf，art或trs的附屬基因（參見，F(xiàn)isheretal.，1986，Science233∶655-659），

5.1編碼LAV/HTLVⅢ病毒蛋白的基因或基因片段的分離。

LAV/HTLVⅢ基因的分離涉及到首先分離出含所需基因順序（如外殼或gag）的DNA碎片。如前所述，LAV/HTLVⅢ有一個(gè)RNA基因組，于是，編碼LAV/HTLVⅢ的基因相應(yīng)的DNA可用以下任何一種方法獲得。（a）通過從純化病毒子中分離出來的RNA進(jìn)行CDNA克?。╞）通過從LAV/HTLVⅢ感染細(xì)胞獲得的含Poly（A）的RNA進(jìn)行cDNA克?。╟）克隆從LAV/HTLVⅢ感染細(xì)胞純化出來的基因組DNA。此后，這里的LAV/HTLVⅢDNA就是指編碼LAV/HTLVⅢ的基因的DNA。

為了產(chǎn)生LAV/HTLVDNA碎片，LAV/HTLVⅢDNA可用各種限制性內(nèi)切酶在一些特殊位點(diǎn)進(jìn)行剪切?？稍阱i存在的條件下使用脫氧核糖核酸酶（DNase）將DNA切成碎片;也可以用物理方法剪切DNA，例如用聲波。然后線形的DNA片段就可以按其大小用規(guī)范化的技術(shù)分離出來，其中包括（但不限于此方法）瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電脈，以及柱層析等技術(shù)。

假如（限制性）酶不破壞蛋白基因產(chǎn)物的產(chǎn)生抗原能力，任何一種或合并幾種限制性內(nèi)切酶均可用以切取含外殼或gag順序的LAV/HTLVⅢDNA碎片。例如，一個(gè)蛋白質(zhì)的抗原性位點(diǎn)可含有約7-14個(gè)氨基酸，那么一個(gè)如外殼多肽前體（約97，000道爾頓）大小的蛋白，就含有許多不連續(xù)的抗原位點(diǎn)。再考慮到其中的重迭順序二級(jí)三級(jí)結(jié)構(gòu)，一些加工過程，如?；腔?，磷酰化，這樣抗原部位可能含有幾千個(gè)。然而許多區(qū)段的部份外殼的多肽基因順序又可能編碼在同一個(gè)抗原部位。結(jié)果是，許多限制性內(nèi)切酶將組合起來用以獲得DNA片段，這些片段當(dāng)被插入到適當(dāng)?shù)妮d體中時(shí)，能夠指導(dǎo)生成含有不同抗原決定簇的外殼特有的氨基酸順序。

當(dāng)生產(chǎn)出DNA碎片以后，對(duì)含所需LAV/HTLVⅢ基因的DNA碎片的鑒別可以通過各種方法來實(shí)現(xiàn)。首先，可以排出與相對(duì)于整個(gè)LAV/HTLVⅢ基因組的有關(guān)的DNA碎片的順序，然后分別根據(jù)預(yù)測(cè)的氨基酸順序與外殼蛋白或gag核蛋白的比較，來確定含外殼蛋白基因或gag基因順序的碎片。其次，一旦整個(gè)基因組順序被確定后，大的開放可讀結(jié)構(gòu)可以從5′到3′編序。由于至今為止測(cè)定過的所有逆行病毒的基因組排布，都是5′gag-pol-env-3′大的開放可讀結(jié)構(gòu)中鄰近3′端的部位極可能構(gòu)成外殼基因，而其5′端很可能構(gòu)成gag基因。第三，特殊基因的鑒別可以通過識(shí)別與其他已知的逆行病毒的同源性來實(shí)現(xiàn)，或者是通過核酸雜交分析，或者假如順序已知的話通過順序比較。

另一方面，含外殼或gag基因的片的鑒別可用mRNA選擇來進(jìn)行在此過程中LAV/HTLVⅢDNA片段以雜交的方法用于分離互補(bǔ)的mRNA。分離得到的mRNA。在體外翻譯產(chǎn)物進(jìn)行免疫沉淀分析顯示了需識(shí)別的mRNA，于是也鑒定出了含外殼gag蛋白基因順序的互補(bǔ)LAV/HTLVⅢDNA碎片。最后用選得特定的mRNA（來自吸收的多核糖體，該核糖體系來自LAV/HTLVⅢ感染細(xì)胞）以固定受外殼或gag蛋白質(zhì)指導(dǎo)的抗體作為模板，可以合成有射性標(biāo)記的LAV/HTLVⅢcDNA（互補(bǔ)DNA）。這樣，含放射性標(biāo)記的mRNA或cDNA就可作為探針用于鑒定含外殼或gag基因順序的LAV/HTLVⅢDNA片段。分離外殼或gag蛋白基因的方法（但不限于這方法）還包括化學(xué)合成基因順序本身（假如順序是已知的），或者制取編碼外殼或gag基因的mRNA互補(bǔ)DNA（cDNA）。

當(dāng)鑒定及分離完成以后，含有我們所感興趣的順序的LAV/HTLVⅢDNA片段先被插入到一個(gè)克隆載體，例如一個(gè)質(zhì)粒克隆載體中去，這載體將轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞以復(fù)制DNA，這樣就可產(chǎn)生我們感興趣的LAV/HTLVⅢ順序序的許多考貝。這過程是將LAV/HTLVⅢDNA片段結(jié)扎到克隆載體中互補(bǔ)粘附著的末端上。但如果克隆載體中沒有與LAV/HTLVⅢDNA片段上互補(bǔ)限制性位點(diǎn)相應(yīng)的部位時(shí)，那么DNA分子的末端就需經(jīng)過加工，這種加工修飾包括產(chǎn)生平頭末端，其方法是消化末端部位的單鏈DNA，或者補(bǔ)上與末端單鏈DNA互補(bǔ)的DNA段，這樣末端便可平頭結(jié)扎。另外，任何需要的位點(diǎn)都可用將核苷酸順序結(jié)扎到DNA末端上的方法來獲得;這些結(jié)扎段可包括經(jīng)特殊化學(xué)合成的編碼限制性位點(diǎn)上能識(shí)別順序的低核苷酸。根據(jù)其他方法，剪切后的載體和LAV/HTLVⅢDNA碎片可以用加上同聚物尾段的方法來加工。

分離的基因或cDNA或合成DNA順序的結(jié)合所形成的重組DNA分子轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞，能產(chǎn)生基因的許多考貝。這樣，只要培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從轉(zhuǎn)化子中分離出重組DNA分子，就可獲得大量基因，如有必要，還可以由分離出來的重組DNA分子中分離取回感興趣的基因。

如果最終目的是將基因插入病毒表達(dá)載體如牛痘病毒或腺病毒，考慮到受病毒感染的細(xì)胞的基因重組與LAV/HTLVⅢ基因結(jié)合的重組DNA分子可被修飾，以使基因被夾在病毒順序中間。這樣，基因便可插入病毒基因組中。

整個(gè)LAV/HTLVⅢ基因現(xiàn)已由Wain-Hobson（Wain-Hobson，S.etal，1985，Cell40∶9）等克隆，包含一個(gè)克隆，指定為包含一9.2千對(duì)堿基的LAV/HTLVⅢ染色體順序中并插進(jìn)λL47.1的HindⅢ位的DNA碎片的λJ19。一個(gè)含有LAV/HTLVⅢ外殼基因的特別有用的λ-J19亞克隆是PRS-3，它包括3，840個(gè)堿基對(duì)的EcoRⅠ到SstⅠ的LAV/HTLVⅢ核苷酸順序碎片，這個(gè)碎片被插入到Puc18的EcoRⅠ和SstⅠ位置之間。PRS-3中含有的LAV/HTLVⅢ特定的DNA系位于LAV/HTLVⅢ基因組中從第5289位核苷酸EcoRⅠ位點(diǎn)到第9129位核苷酸的SstⅠ位置之間的區(qū)段。（Wain-Hobson，S.，etal.，1985，Cell40∶9）：見圖2，其中描述了PRS-3中所含的LAV/HTLVⅢ核苷酸順序。然而由于核苷酸密碼順序的降解，如圖2中描述的其他編碼同樣氨基酸順序的DNA也可用于達(dá)到本發(fā)明中克隆LAV/HTLVⅢ基因的目的。這些包括但并不局限于含所有或部分外殼核苷酸順序的DNA順序，如圖2所示這些順序可被編碼同種或功能相當(dāng)?shù)陌被釟埢ㄈ缦嗤瑯O性的氨基酸）的不同密碼子所取代這樣便導(dǎo)致了一個(gè)暗藏的改變。

特別有用的含LAV/HTLVⅢgag基因的λJ19亞克隆是PKs-5和PSS-5。PKs5質(zhì)粒含Puc18中從SstⅠ到KpnⅠ3，148堿基對(duì)的LAV/HTLVⅢ片段。PKs-5中的LAV/HTLVⅢ特定DNA系來自于LAV/HTLVⅢ基因組內(nèi)從224位核苷酸的SstⅠ位點(diǎn)到3，372位核苷酸的KpnⅠ位點(diǎn)。PSS-5質(zhì)粒包含Puc18中SstⅠ到SalⅠLAV/HTLVⅢ碎片的5.1千個(gè)堿基對(duì)。外殼的PSS-5的LAV/HTLVⅢ特定的DNA系來自LAV/HTLVⅢ基因組中從224位核苷酸的SstⅠ位點(diǎn)到5331位核苷酸的SalⅠ位點(diǎn)之間的區(qū)段。（Wain-Hobson，S.，etal.，1985.Cell40∶9），見圖14，其中描述了在Pks-5和PSS-5中的LAV/HTLVⅢ核苷酸順序。但是因?yàn)槊艽a順序核苷酸的降解，如圖14中所示，其他編碼相同氨基酸順序的DNA順序也可用在本發(fā)明中，克隆LAV/HTLVⅢ的gag基因。這些包括但不限于含所有或部分外殼核苷酸順序的DNA順序。如圖14所示，這些順序可被編碼同種或功能相當(dāng)?shù)陌被釟埢ɡ缦嗤瑯O性的氨基酸）的不同密碼子所取代。這樣便導(dǎo)致一個(gè)暗藏的改變。

5.2LAV/HTLVⅢ蛋白編碼順序

插入表達(dá)載體。

編碼LAV/HTLVⅢ蛋白如外殼gag或其中一部分的核苷酸順序編碼被插入到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，即一個(gè)具備轉(zhuǎn)錄，翻譯插入蛋白編碼順序所需要的載體。在各種宿主一載體系統(tǒng)可用于蛋白編碼順序的表達(dá)。這里包括但并不限于病毒（如牛痘病毒，腺病毒等）感染的脯乳類細(xì)胞系統(tǒng);病毒（如桿狀病毒）感染的昆蟲細(xì)胞;微生物如含酵母載體的酵母菌或者用噬菌體DNA，質(zhì)粒DNA或柯斯DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。這些載體的表達(dá)因素根據(jù)它們的表達(dá)能力和特性而不同?？克鶓?yīng)用的宿主一載體系統(tǒng)，許多適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄翻譯要求素的任一項(xiàng)都能使用。例如，當(dāng)在哺乳類細(xì)胞系統(tǒng)中克隆時(shí)，可使用由哺乳類細(xì)胞基因組分離出來的啟動(dòng)子（如鼠metallothionien啟動(dòng)子）或由這些細(xì)胞中生長的病毒中分離的啟動(dòng)子（如牛痘病毒7.5k啟動(dòng)子）重組DNA產(chǎn)生的或合成技術(shù)得到的啟動(dòng)子也可用于參與插入順序的轉(zhuǎn)錄過程。

插入蛋白編碼順序的有效翻譯同樣需要特定的起始信號(hào)。這些信號(hào)包括ATG起始密碼子及其鄰近順序。當(dāng)整個(gè)的LAV/HTLVⅢ外殼或gag基因包括它自身的起始密碼子及其鄰近順序被插入到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中時(shí)，就不再需要另行加入翻譯控制信號(hào)。當(dāng)只有外殼或gag編碼順序的一部分被插入時(shí)，必須提供外源的翻譯控制信號(hào)，包括ATG起始密碼子。此外，起始密碼子必須與蛋白編碼基因的閱讀結(jié)構(gòu)相協(xié)調(diào)以保證整個(gè)插入順序的翻譯。這些外源的翻譯控制信號(hào)和起始密碼子可以是各種來源來的，天然的或合成的均可。

前述的DNA碎片插入至載體的方法中的任何一種方法都可用于組建含一個(gè)嵌合基因的表達(dá)載體，這個(gè)嵌合基因由適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄/翻譯控制系統(tǒng)和蛋白編碼順序組成。這些方法可以包括體外重組DNA和合成技術(shù)，以及體內(nèi)重組（基因重組）。

在本發(fā)明實(shí)施例中選擇了牛痘病毒及桿狀病毒作為表達(dá)載體。但本發(fā)明并不僅限于使用牛痘病毒和桿狀病毒。如前所述，可以使用的表達(dá)載體包括但不限于以下載體或它們的衍生物：人或動(dòng)物病毒如牛痘病毒或腺病毒;昆蟲病毒如桿狀病毒;酵母載體;噬菌體載體和質(zhì)粒及柯斯DNA載體還有其他一些等等。

當(dāng)腺病毒被用作表達(dá)載體時(shí)，將LAV/HTLVⅢ基因結(jié)扎到一個(gè)腺病毒轉(zhuǎn)錄一翻譯控制復(fù)合體上，例如，遲生基因啟動(dòng)子和三聯(lián)引導(dǎo)順序。而后這個(gè)嵌合基因通過體外或體內(nèi)重組插入到腺病毒基因組中。插入到病毒基因組的非必需區(qū)域（如區(qū)域E1或E3）將產(chǎn)生有活力的重組體病毒，它能在感染的宿主細(xì)胞中表達(dá)與LAV/HTLVⅢ有關(guān)的蛋白。目前，已有腺病毒的兩個(gè)株（4型和7型）被獲準(zhǔn)并作為軍事人員使用的疫苗。它們是最初的選為表達(dá)LAV/HTLVⅢ基因的載體。

另外，還要選擇宿主細(xì)胞株，它需要能調(diào)節(jié)插入順序的表達(dá)，或能按所期望的特殊形式修飾和加工嵌合基因的產(chǎn)物。始于一定啟動(dòng)子的表達(dá)可由于某種誘導(dǎo)物的存在而得到增強(qiáng)（如鋅和鈣離子對(duì)于metallothionein啟動(dòng)子的作用）。于是基因操縱的LAV/HTLVⅢ蛋白的表達(dá)得到了控制。如果外來基因克隆的蛋白產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞是致死的，這種控制就顯得十分重要。此外，蛋白產(chǎn)物的修飾（如糖基化），加工（如剪切）對(duì)蛋白的功能也很重要。不同的宿主細(xì)胞都具特有的蛋白翻譯后的加工修飾機(jī)制。通過選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系或宿主系統(tǒng)可以保證外源基因表達(dá)的蛋白的正確修飾和加工。

本發(fā)明的兩個(gè)實(shí)施例中，我們分別把LAV/HTLVⅢ外殼密碼順序（分別是順序的全部和其一部分兩種形式）及LAV/HTLVⅢgag密碼順序與牛痘病毒的7.5k啟動(dòng)子相結(jié)扎，在各種質(zhì)粒中形成了嵌合基因。這些質(zhì)粒中的嵌合基因被放在牛痘病毒Tk基因同源的附加疫苗病毒順序的側(cè)面。嵌合基因的結(jié)構(gòu)涉及到使用天然和合成的核苷酸，這些核苷酸是編碼LAV/HTLVⅢenv或LAV/HTLVⅢgag順序轉(zhuǎn)錄和翻譯的控制信號(hào)。然后通過質(zhì)粒載體和牛痘病毒基因庫同源TK區(qū)域之間的體內(nèi)重組，將這些嵌合基因?qū)胍呙绮《颈磉_(dá)載體。這些含嵌合基因的重組病毒作為表達(dá)載體，產(chǎn)生LAV/HTLVⅢ外殼有關(guān)的蛋白或LAV/HTLVⅢgag有關(guān)的蛋白。

在本發(fā)明的其他實(shí)施例中，我們分別將LAV/HTLVⅢ外殼密碼順序及LAV/HTLVⅢgag密碼順序與AutographaCalifornica核心多面體病毒（ACNPV）的多面體啟動(dòng)子相結(jié)扎，在各種質(zhì)粒中形成了嵌合基因。這些質(zhì)粒中的嵌合基因兩側(cè)是附加的ACNPV順序。嵌合基因的構(gòu)成，涉及到天然核苷酸的使用，這些核苷酸編碼LAV/HTLVⅢgag或env順序轉(zhuǎn)錄翻譯的控制信號(hào)。然后通過質(zhì)粒載體和ACNPV基因組同源DNA之間的體內(nèi)重組，將嵌合基因?qū)階CNPV表達(dá)載體。這些嵌合基因的重組病毒用作表達(dá)載體;以產(chǎn)生與LAV/HTLVⅢ外殼相關(guān)的蛋白或與LAV/HTLVⅢgag相關(guān)的蛋白。

5.3表達(dá)具有復(fù)制和表達(dá)插入基因的載體的重組體的鑒定

含有外源插入基因片段的表達(dá)載體可由三條常用途徑鑒定。（a）DNA-DNA雜交（b）“標(biāo)記”基因功能的出現(xiàn)或消失（c）插入順序的表達(dá)。第一條途徑，插入表達(dá)載體外源基因的出現(xiàn)，可用含有與外源插入基因同源順序的探針的DNA-DNA雜交來測(cè)定。第二條途徑，重組載體/宿主系統(tǒng)可在某些由于載體中外源基因的插入引起的某些“標(biāo)記”基因功能（就是胸腺嘧啶激酶活力，抗菌素抗性，轉(zhuǎn)化表現(xiàn)型，桿狀病毒閉塞體的形成等等）出現(xiàn)或消失的基礎(chǔ)上進(jìn)行鑒定的和篩選。例如，如果LAV/HTLVⅢ基因插入到載體標(biāo)志基因順序中時(shí)，包含LAV/HTLVⅢ插入碎片的重組體可由標(biāo)記基因功能的喪失進(jìn)行鑒定。第三個(gè)途徑，重組表達(dá)載體可通過測(cè)定重組體的外源基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定?？稍谖锢韺W(xué)，免疫學(xué)或基因產(chǎn)物的功能性質(zhì)方面的基礎(chǔ)上進(jìn)行測(cè)定。

一旦一個(gè)特別的重組DNA分子得到鑒定和分離，可用幾種方法進(jìn)行繁殖，取決于這樣的重組體是否構(gòu)成自我復(fù)制單位（復(fù)制子）。一個(gè)自我復(fù)制單位，比如質(zhì)粒，病毒，細(xì)胞等。在適合的細(xì)胞環(huán)境和生長條件下能自我繁殖。為了繁殖缺少自我復(fù)制單位的重組體必須與具有這種復(fù)制單位的分子結(jié)合為一整體。例如，某些轉(zhuǎn)入宿主的表達(dá)質(zhì)粒載體需要與細(xì)胞染色體結(jié)合在一起以保證繁殖和重組基因的穩(wěn)定表達(dá)。一旦建立了合適的宿主系統(tǒng)和生長條件，重組表達(dá)載體就可繁殖和大量制備。

本發(fā)明的一個(gè)在例子中詳細(xì)敘述的實(shí)施例中，包含LAV/HTLVⅢ的env或gag密碼順序的插入基因被插入到牛痘病毒染色體中的TK基因中，然后病毒轉(zhuǎn)變成TK-，就喪失了病毒產(chǎn)生胸腺嘧啶激酶的能力。這樣的重組體可利用它們?cè)诤?-溴脫氧尿嘧啶及一種使TK+細(xì)胞致死但不使TK-細(xì)胞致死的核苷類似物的培養(yǎng)基上的生長能力來選擇。

使用LAV/HTLVⅢenv或LAV/HTLVⅢgag特異探針，通過DNA-DNA雜交，對(duì)重組體進(jìn)行進(jìn)一步確定。TK-重組病毒通過空斑純化而分離。病毒株可以從被感染的組織培養(yǎng)細(xì)胞獲得。

在例子中詳細(xì)討論的本發(fā)明的實(shí)施例中，將LAV/HTLVⅢ的env或gag密碼順序的基因碎片段插入AcNPV染色體的多面體基因中，從而使病毒轉(zhuǎn)變成非閉塞的表現(xiàn)型。這些重組體可觀察出它們?nèi)狈﹂]塞的病毒顆粒，從而被挑選出來。重組體通過Northern斑點(diǎn)分析法，利用LAV/HTLVⅢenv或gag專一性探針進(jìn)一步被識(shí)別。重組病毒通過空斑純化而分離，從被感染的組織培養(yǎng)細(xì)胞中可獲得病毒株。

5.4基因表達(dá)產(chǎn)物的識(shí)別和純化

具有LAV/HTLVⅢ基因的重組體被識(shí)別后，就可以分析該基因的產(chǎn)物?？梢酝ㄟ^物理或免疫的方法或根據(jù)產(chǎn)物功能的特性對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析。免疫分析具有特別重要的意義，因其最終目的是使用基因產(chǎn)物及能夠表達(dá)用于疫苗配方中的產(chǎn)物并/或在免疫測(cè)定診斷中作為抗原的重組病毒。

許多抗血清可用于分析下述的產(chǎn)物的免疫反應(yīng)性，這些產(chǎn)物包括但不局限于：取自LAS或AIDS病人的血清及多價(jià)的直接針對(duì)LAV/HTLVⅢ病毒的抗血清，病毒外殼蛋白，或由gag基因編碼的核芯蛋白?？乖肿影?xì)菌系統(tǒng)產(chǎn)生的類似物，或者含LAV/HTLVⅢ外殼抗原決定簇的合成肽，或者核芯抗原。本發(fā)明中描述的肽和蛋白的識(shí)別是基于如下兩個(gè)要求：第一，與LAV/HTLVⅢ有關(guān)的蛋白僅在重組體病毒感染后的細(xì)胞中產(chǎn)生。第二，LAV/HTLVⅢ有關(guān)的蛋白要對(duì)AIDS病患者血清有免疫反應(yīng)，或與各種針對(duì)LAV/HTLV外殼或者核芯蛋白或它們的類似物、衍生物有免疫反應(yīng)。

蛋白必須有免疫反應(yīng)活性，無論其來自整個(gè)基因順序或基因順序的一部分，還是來自兩個(gè)或兩個(gè)以上結(jié)扎在一起指導(dǎo)合成匯合蛋白的基因。這種反應(yīng)活性可以通過標(biāo)準(zhǔn)的免疫學(xué)技術(shù)顯示出來，如用放射免疫沉淀分析、放射性免疫競爭或，免疫斑點(diǎn)（immunoblots）的方法。

當(dāng)LAV/HTLVⅢ有關(guān)的蛋白鑒定出來以后，可以用標(biāo)準(zhǔn)方法將其分離純化出來，這此方法包括層析（如離子交換、親和層析及按分子大小設(shè)計(jì)的柱層析）離心，溶解度差異、或其他分離純化蛋白所用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。

另一方面，一旦一個(gè)有免疫反應(yīng)活性的由重組體產(chǎn)生的LAV/HTLVⅢ有關(guān)蛋白的蛋白鑒定出來以后，該蛋白中的氨基酸順序可由重組體中嵌合基因的核苷酸順序推斷出來。于是，這種蛋白就可通過已知的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法進(jìn)行合成。（如：見Hunkapiller，M.etal.，1984，Nature310∶105-111）

本發(fā)明實(shí)施例中的這些肽無論是來自重組DNA技術(shù)還是來自化學(xué)合成法，都包括但非僅限于如圖2或圖14所描述的全部氨基取順序，還包括這樣一種情況，即順序中氨基酸殘基被功能相當(dāng)?shù)陌被釟埢〈鹨粋€(gè)暗藏的順序變化。如，順序中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)功能相當(dāng)?shù)陌被釟埢ㄈ鐦O性相同）所取代，這就引起一個(gè)所謂的暗藏變化。順序中某一氨基酸的取代物可以從該氨基酸所屬組系的其他成員中選擇。例如，非極性氨基酸（疏水的）包括丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。中性極性氨基酸包括酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰氨。帶正電（堿性）氨基酸包括精氨酸、賴氨酸、組氨酸。帶負(fù)電荷（酸性）氨基酸包括天冬氨酸、及氨酸。

5.5重組體產(chǎn)物免疫活力的確定

LAV/HTLVⅢ有關(guān)的產(chǎn)物的免疫能力可以通過這樣的方法來確定：即監(jiān)測(cè)經(jīng)過純化的蛋白或合成的肽或蛋白免疫后，試驗(yàn)動(dòng)物的免疫應(yīng)答。當(dāng)LAV/HTLVⅢ有關(guān)的蛋白被具感染性的重組病毒來表達(dá)時(shí)，重組病毒本身即可使試驗(yàn)動(dòng)物免疫。試驗(yàn)動(dòng)物可以包括老鼠、兔、黑猩猩，最終是人類的受驗(yàn)者。導(dǎo)入免疫原的方法可以包括口服，皮內(nèi)注射，肌肉注射，腹膜內(nèi)注射，靜脈內(nèi)注射，皮下注射，鼻腔內(nèi)的，或其他任何標(biāo)準(zhǔn)的免疫途徑。試驗(yàn)體的免疫應(yīng)答可以通過三種途徑來分析（a）用已知的技術(shù)如結(jié)合酶的免疫吸收分析（ELISA）、免疫班點(diǎn)（immunoblots）、放射性免疫沉淀分析等等，分析得到的生成物免疫血清對(duì)真正的LAV/HTLVⅢ病毒抗原的反應(yīng)活性。（b）免疫血清在體內(nèi)中和LAV/HTLVⅢ的傳染的能力。（Robert-Guroff，M，1985，Nature316∶72-74）（旨在測(cè)定抗外殼抗體），及（c）預(yù)防LAV/HTLVⅢ的感染和/或減輕被免疫的動(dòng)物的感染癥狀。（Francis，D.P，1984，Lancet2∶1276-1277∶Gujdusek，D.C.1985，Lancet1∶55-56）。

5.6疫苗配方

本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施例的目的是配制一種疫苗，該疫苗中的免疫原系與LAV/HTLVⅢ抗原決定基相關(guān);或者該疫苗含有一種重組病毒，該重組病毒表達(dá)的免疫原針對(duì)LAV/HTLVⅢ病毒感染激起保護(hù)性應(yīng)以的預(yù)防LAS或AIDS病。另外，多價(jià)疫苗配方可以制備成具有多個(gè)LAV/HTLVⅢ相關(guān)的免疫原決定簇。這樣的疫苗包括但不局限于下述情況：含LAV/HTLVⅢ外殼相關(guān)決定基的疫苗單獨(dú)或與其他的LAV/HTLVⅢ決定基，如gag相關(guān)決定基共同使用。這樣同時(shí)包含了env及gag編碼的抗原決定基的多價(jià)疫苗，在防止AIDS病的擴(kuò)展很有意義。當(dāng)兩組病人產(chǎn)生針對(duì)外殼抗原簇的抗體時(shí)，其中未顯示病征病人相比之下顯得產(chǎn)生更多的抗-gag抗體。（Science，1986，233∶419）。有關(guān)研究還顯示AIDS病人在早期未顯示病征階段同時(shí)產(chǎn)生針對(duì)外殼蛋白和核芯蛋白（gag）的抗體。

隨著病情的加重，病征顯現(xiàn)出來后，抗-gag抗體減少，同時(shí)抗外殼抗體數(shù)量保持早先水平（Science，1986，233∶282）。在疫苗配方中的gag相關(guān)的抗原決定基的包涵物，對(duì)于LAV/HTLVⅢ相關(guān)疾病的免疫預(yù)防及免疫治療具有特殊意義。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例對(duì)該包涵物的制備作了專門的描述。

多價(jià)疫苗能配入含有LAV/HTLVⅢ基因產(chǎn)物和/或表達(dá)插入基因產(chǎn)物的重組病毒。這些也能與其他抗原混合用于LAS或AIDS病和其他疾病的預(yù)防。接下來是病毒配方舉例。

5.6.1病毒疫苗配方

無論是用活的重組病毒疫苗還是滅活的重組病毒疫苗都能配制。怎樣選擇依賴于表達(dá)LAV/HTLVⅢ相關(guān)抗原決定基的重組病毒的性質(zhì)。重組病毒對(duì)被免疫的宿主具有感染力但不會(huì)致病?；畹囊呙缡莾?yōu)先選用的因?yàn)樗谒拗髦性鲋晨裳娱L類似物的刺激對(duì)發(fā)生自然臨床癥狀不明顯的感染非常重要，因而提供了充實(shí)的長時(shí)間免疫。導(dǎo)入宿主動(dòng)物的具有感染力的重組病毒能由它的插入基因表達(dá)LAV/HTLVⅢ的相關(guān)蛋白，從而刺激對(duì)LAV/HTLVⅢ抗原的免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答對(duì)后繼LAV/HTLVⅢ挑戰(zhàn)具有保護(hù)作用的情況下，活的重組病毒本身可被用作對(duì)AIDS病毒傳染的預(yù)防疫苗。這樣的重組病毒產(chǎn)物可被用在體外（如組織培養(yǎng)細(xì)胞）和體內(nèi)（如自然宿主）系統(tǒng)的配方中。在這點(diǎn)上對(duì)牛痘病毒重組體尤其有用。常規(guī)制備方法和天花疫苗配方可用活的重組病毒疫苗配方。（例見VaccinicVirusesandFactorsforVaccineAntigens，Ed，Quinnan，G.V.，Elsevier，1985，PP，109-116）。

多價(jià)活病毒疫苗可用一種或一些具有感染力的表達(dá)幾種LAV/HTLVⅢ相關(guān)抗原決定基的重組病毒來制備。疫苗也可以包括表達(dá)導(dǎo)致其他疾病的有機(jī)體抗原表位的病毒，加上LAV/HTLVⅢ的抗原表位。例如牛痘病毒（能接納約35千對(duì)堿基的外源DNA）被設(shè)計(jì)含有LAV/HTLVⅢ抗原表位和與其外殼和gag相關(guān)抗原表位基的編碼順序。病毒也可能編碼其他LAV/HTLVⅢ的抗原表位。象這樣的重組病毒本身也能在多價(jià)疫苗中被用作免疫原。疫苗的混合物或其他病毒指導(dǎo)不同的編碼。不同LAV/HTLVⅢ和/或其他致病生物體的抗原表位表達(dá)的各種功能可被綜合于多價(jià)疫苗的免疫原中。無論如何，重組病毒對(duì)被免疫的宿主是有感染力的，可以制成滅活疫苗的配方。在某種意義上滅活疫苗是“死的”它們的感染力已消失。通常用甲醛處理。在理想狀況下，病毒的感染力是被破壞了但不影響其衣殼或具有病毒免疫原性的抗原決定基蛋白。為制備滅活疫苗，大量重組病素必須在培養(yǎng)中生長以便提供足夠量的有關(guān)抗原。表達(dá)不同抗原表位的滅活病毒混合物可被用來配制多價(jià)疫苗。在某些情況下，上述方法比采用活的疫苗配方為佳，因?yàn)楸苊饬嘶畈《局g的互助干擾帶來的問題。在任一情況下，滅活的重組病毒或病毒混合物應(yīng)與適當(dāng)?shù)淖魟┮黄鹋渲埔栽鰪?qiáng)其抗原的免疫應(yīng)答。合適的佐劑包括，但不并限于：無機(jī)凝膠如氫氧化鉛，表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂，普魯蘭尼克多元醇，聚陰離子，肽類，油性乳劑，及人體潛在佐劑如BCG（bacillecalmette-Guerin）和小桿菌。（corynebacteriumparvum）。

有許多方法可以用以配制上述疫苗配方，它們包括口服及通過皮內(nèi)、肌肉、腹膜腔、靜脈、皮下或鼻腔接觸等途徑，但并不僅限于這些。當(dāng)在配方中利用活的病毒重組體疫苗時(shí)，則可以采用親本野生型病毒自然感染途徑，其中親本野生型病毒在疫苗配方中用以制備重組體病毒。

5.6.2亞單位疫苗配方

對(duì)于一種病毒疫苗，在亞單位配方中，LAV/HTLVⅢ相關(guān)蛋白本身用作免疫原（而且可以是多價(jià)的）來使用。如前所述亞單位疫苗僅僅包括使宿主獲得免疫所必需的相關(guān)免疫物質(zhì)，以便宿主免疫。相應(yīng)地，從重組體中提純的LAV/HTLVⅢ相關(guān)蛋白能夠表達(dá)LAV/HTLVⅢ抗原表位。這些表達(dá)LAV/HTLVⅢ抗原表位基的重組體包括了如前所述的病毒感染培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌轉(zhuǎn)移株、酵母轉(zhuǎn)移株或被病毒感染的昆蟲（參見5.2，5.3及5.4節(jié)）。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，LAV/HTLVⅢ的相關(guān)肽或相關(guān)蛋白可以用化學(xué)方法合成。因而這些肽或蛋白質(zhì)的氨基酸順序可以從指導(dǎo)其表達(dá)的插入基因核苷酸順序來推導(dǎo)。（參見5.4節(jié)）

無論免疫原是從重組體提純的還是化學(xué)合成的，最終的產(chǎn)物都被調(diào)整到合適的濃度并加入合適的疫苗佐劑然后包裝備用。合適的佐劑包括但不僅僅局限于：無機(jī)凝膠如氫氧化鋁;表面活性劑如溶血卵磷脂、普盧蘭尼克氏多元醇、聚陰離子、肽、油質(zhì)乳劑及具有潛在利用價(jià)值的人體佐劑如BCG（bacilleCalmette-Guerin）和小桿菌（corynebacteriumparvum）。在疫苗配方中免疫原與脂質(zhì)體合用或結(jié)合到多糖或其他多聚物上用作疫苗配方。

LAV/HTLVⅢ相關(guān)的肽或蛋白是一種半抗原，也就是說，因其能選擇性與其同族抗體反應(yīng)，而不能激發(fā)免疫應(yīng)答，所以這個(gè)分子有抗原性而無免疫性。這個(gè)半抗原能以共價(jià)健接在一個(gè)載體或免疫分子上。例如;一種大分子蛋白如血清清蛋白與半抗原結(jié)合后使該半抗原具有免疫原性。這種半抗原載體可以配成一種疫苗使用。

5.6.3被動(dòng)免疫和抗特異基因型抗體

和用病毒或亞單位疫苗進(jìn)行的主動(dòng)免疫所不同的是通過控制前期形成的與LAV/HTLVⅢ的一個(gè)或多個(gè)抗原表位對(duì)抗的抗體，可以使宿主獲得短期保護(hù)。因而，上述的疫苗配方能被用來生產(chǎn)抗體而用于被動(dòng)免疫療法。人體免疫球蛋白可以針對(duì)外源的重組免疫原激起免疫應(yīng)答。此種被動(dòng)免疫對(duì)于未經(jīng)免疫而又在醫(yī)院或其他衛(wèi)生機(jī)構(gòu)中冒著接觸AIDS病人危險(xiǎn)的人，提供了一種緊急的保護(hù)的基礎(chǔ)。另一方面，這些抗體能被用于制備抗特異基因的抗體，而該抗特異基因抗體又可作為抗原，針對(duì)LAV/HTLVⅢ抗原表位面激起的免疫應(yīng)答。

本發(fā)明的與LAV/HTLVⅢ相關(guān)的肽和蛋白質(zhì)在免疫測(cè)定中可用作為抗原，以檢測(cè)病人的各種組織和體液以及血庫和醫(yī)院中的血液中對(duì)付LAV/HTLVⅢ的抗體。為此，本發(fā)明的抗原可用于該技術(shù)領(lǐng)域中已知的任何免疫測(cè)定方法，這些方法包括（但不限于）利用下述所列舉技術(shù)的競爭和非競爭測(cè)定法：輻射免疫測(cè)定、酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（ELISA）“夾心片”免疫測(cè)定沉淀素反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)射測(cè)定、凝集測(cè)定、補(bǔ)體固定測(cè)定、免疫放射測(cè)定、熒光免疫測(cè)定、蛋白質(zhì)A免疫測(cè)定和免疫電泳測(cè)定等。

本發(fā)明的負(fù)疫測(cè)定法可用于檢查血庫和病人中的血是否曾暴露在LAV/HTLVⅢ中以及監(jiān)視正在醫(yī)治LAS或愛滋病的病人。按照本發(fā)明，與LAV/HTLVⅢ的抗原有關(guān)的任何肽和蛋白質(zhì)均可用于免疫測(cè)定。這些抗原包括但并不限于與下述基因產(chǎn)物env，gag.pol相關(guān)的肽和蛋白質(zhì)，同時(shí)還包括但并不限于目前剛命名的另外四種基因：sor，tat，3′arf和art（或trs）。的產(chǎn)物相關(guān)的肽和蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)特別實(shí)施例中，一組抗原可在免疫測(cè)定中，用于檢測(cè)病人的對(duì)準(zhǔn)LAV/HTLVⅢ的不同表位的抗體的輪廓。本發(fā)明的另一實(shí)施例中，可以對(duì)已接種本發(fā)明疫苗配方的病人進(jìn)行監(jiān)督，以查明該病人以后是否暴于LAV/HTLVⅢ之中。在這類情況下，免疫測(cè)定中所用的抗原最好是本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)，但所述的肽和蛋白質(zhì)不應(yīng)該是病人接種所用的疫苗配方的免疫原，因?yàn)檫@些接種過的個(gè)人對(duì)于疫苗配方中所用的特殊表位呈血清陽性，結(jié)果是導(dǎo)致試驗(yàn)為陽性，而不管是否暴露在病毒之中。例如，如果一個(gè)病人是用本發(fā)明的與LAV/HTLVⅢ膜相關(guān)的表位進(jìn)行接種，那么該病人應(yīng)當(dāng)使用任何其他的與非外殼LAV/HTLVⅢ有關(guān)的蛋白質(zhì)來進(jìn)行LAV/HTLVⅢ感染的檢查，以確定病人中是否存在對(duì)LAV/HTLVⅢ特異的抗體。因此，可以檢查已接種與外殼有關(guān)的表位的病人是否存在對(duì)LAV/HTLVⅢ核心抗原或者包括但不限于是sor和3′-orf基因產(chǎn)物等的LAV/HTLVⅢ抗原特異的抗體。

又一實(shí)施例中，本發(fā)明的與LAV/HTLVⅢ相關(guān)的肽和蛋白質(zhì)在有竟?fàn)幟庖邷y(cè)定法中用于檢出和測(cè)定病人的血、血清等內(nèi)的LAV/HTLVⅢ-HTLVⅢ編碼的蛋白質(zhì)的存在及其數(shù)量。

6、實(shí)施例：牛痘外殼重組體

在下列各例中，各種質(zhì)粒載體要建造得含有嵌合基因，其中包括位于有關(guān)痘毒的轉(zhuǎn)錄控制順序下面的LAV/HTLVⅢ膜編碼順序的這些含有牛痘啟動(dòng)區(qū)和LAV/HTLVⅢ外殼編碼順序的嵌合基因是通過體內(nèi)重組被插入中痘病毒的基因組內(nèi)。對(duì)這些重組體病毒進(jìn)行鑒定和提純，而病毒原料是由受感染的組織培養(yǎng)細(xì)胞來制備的。已證明免疫反應(yīng)性的LAV/HTLVⅢ外殼相關(guān)的蛋白質(zhì)是在體外由這些重組體牛痘病毒產(chǎn)生的。這些重組體已在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物身上進(jìn)行試驗(yàn)，以了解它們誘發(fā)中和的或保護(hù)性的免疫應(yīng)答的能力，以及它們作為抗愛滋病的疫苗的可能性。下面將對(duì)本發(fā)明的該實(shí)施的每一步驟進(jìn)行詳細(xì)描述。

6、1.總的步驟的程序

6、1、1細(xì)胞和病毒細(xì)胞

美洲綠猴的腎細(xì)胞（BSC-40細(xì)胞，從BSC-1細(xì)胞，ATCCNo，CCL26中得到的非洲綠猴細(xì)胞一種連續(xù)系）是從R.康迪（R.Condit紐約，布法羅，紐約州立大學(xué)生化系副其教授）處得到，并在杜爾佩科（Dulbecco）改進(jìn)的伊格爾培養(yǎng)基（DMEM，Gibco，GrandIsland，NY）中繁殖，在上述培養(yǎng)基中還加入10%牛胚胎血清和用量各為每毫升100單位的青霉素和鏈霉素。人體143TK-細(xì)胞（Rhim，J.Setal.，1975，Intl.J.Cancer15∶23-29）是從M.博查（M.Botchan，加利福尼亞州，伯克利，加利福尼亞大學(xué)分子生物系教授）處得到，并在添加用量為25微克/毫升的6-溴脫氧尿苷（BUdR）的上述培養(yǎng)基中繁殖。

人的二倍體細(xì)胞（MRC-5）是取自美國典型培養(yǎng)物標(biāo)本（ATCCNO.CCL171），并在與BSC-40所用的相同培養(yǎng)基中繁殖。

牛痘病毒（WR系，ATCCNO，VR-119）是從R.康迪處得到，然后在含有下列培養(yǎng)溶液的BSC-40細(xì)胞中增長，該培養(yǎng)溶液由下列成分組成：DMEM+5%丙種球蛋白游離小牛血清+100單位/毫升的青霉素+100單位/毫升的鏈霉素。TK重組體選自含有25微克/毫升溴脫氨尿苷（BUdR）的同樣培養(yǎng)基中的143TK細(xì)胞，并在DMEM培養(yǎng)溶液中的同樣細(xì)胞系上進(jìn)行斑塊提純，所述溶液中還含有1%諾布爾瓊脂（DIFCO.DetraitMICH），5%丙種蛋白游離小牛血清，濃度各為100單位/毫升的青霉素和鏈霉素，以及25微克/毫升溴脫脂氧尿苷。病毒原材料在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS，每升含有8克NaCl0.2克KCl，1.5克NaH2PO4和0.2克K2HPO4）中稀釋，上述磷酸緩沖鹽水添加有1毫克分子MgCl2和0.01%牛血清白蛋白（PBSAM）。

紐約市衛(wèi)生局的牛痘病毒株是從懷爾夫（wyeth）實(shí)驗(yàn)室（Marietta，PA）銷售的天花疫苗（DryvaxLot321501G）商品制造中提純得到的。天花疫苗是用PBSAM（見下文）稀釋，再在BSC-40細(xì)胞上接連進(jìn)行斑塊提純?nèi)?。病毒原材料（以下稱為v-NY）是經(jīng)這種斑塊提純分離的在BSC-40細(xì)胞上制得，并用于制備重組體病毒。從v-NY得到的重組體病毒原材料被放在MRT-50細(xì)胞上繁殖。

6、1、2，DNA的制備、限制和修飾

除另有規(guī)定外，下述操作所用的全部方法均如文獻(xiàn)（Maniatisetal.，1982.MolecularCloning，ColdSpringHarborLarboatory）中有關(guān)部分所描述的那樣：質(zhì)粒DNA的制備（pp.86-96），DNA的限制消化（pp.98-106）和從低熔融溫度的瓊脂糖凝膠中限制碎片的提純（pp.157-161和p.170）Klenow碎片大腸埃希桿菌DNA聚合酶反應(yīng)（pp.107-114）小牛腸的堿性磷酸酶反應(yīng)（pp.133-134）連接酶反應(yīng)（p.146）的反應(yīng)條件，切口轉(zhuǎn)譯探針的制備（pp.109-112）和DNA-DNA雜交方法（pp.324-325）

6、2含有與LAV/HTLVⅢENV基因連接的牛痘病毒啟動(dòng)區(qū)的質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)

下面小段描述了含有前面位置為牛痘病毒轉(zhuǎn)錄控制順序的LAV/HTLVⅢ膜基因的各種質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)，這些嵌合順序側(cè)面與TKDNA相接。以后，這些重組體質(zhì)粒載體用于將LAV/HTLVⅢ膜編碼順序通過活體內(nèi)重組后插入痘苗病毒的基因組中。

在下述小段中敘述的是，LAV/HTLVⅢ膜編碼順序是從PRS-3提純的，PRS-3是入J19的一個(gè)亞克?。╓ain-Hobson，S.，etal.，1985，Cell40∶9）并插入PGS20中所包含的牛痘7.5k啟動(dòng)區(qū)下方的質(zhì)粒PGS20之中（Mackett，M.，Smith，G.L.andMoss，B.，1984，J.Virol.49，857-864），以構(gòu)成pv-env1，pv-env2，pv-env5和pv-env7。在這些結(jié)構(gòu)中每個(gè)結(jié)構(gòu)，嵌合基因（即將牛痘7.5k啟動(dòng)區(qū)連接到LAV/HTLVⅢ特異的核苷酸順序中）側(cè)面與牛痘TK基因順序相接。

如前所述，PRS-3是由克隆到PUC18的ECORⅠ和SstⅠ位置的λJ19包含的LAV/HTLVⅢDNA插入物的一個(gè)3840堿基對(duì)EcoRⅠ至SstⅠ碎片組成。它是通過將J19的SstⅠ限制碎片克隆到PUC18的SstⅠ位置，以創(chuàng)造PBT-1，后者再用EcoRⅠ消化和重新連接。這種DNA用于改變大腸桿菌（E.coli），而質(zhì)粒PRS-3被分離出來。PRS-3所包含的LAV/HTLVⅢ特異的DNA是在LAV/HTLVⅢ基因組中從位于核苷酸5289的EcoRⅠ位置至位于核苷酸9129的SstⅠ位置（wain-Hobson，S.，etal.，1985，Cell40∶9）;見圖2。

6、2、1.含有與LAV/HTLVⅢENV基因的3編碼順序相連接的牛痘病毒啟動(dòng)區(qū)的質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)

5微克PRS-3質(zhì)粒DNA用限制酶KpnⅠ消化完全，所產(chǎn)生的碎片溶解在1%低熔融溫度的瓊脂糖凝膠中。然后分離出一個(gè)2.68千堿基對(duì)（Kbp）碎片，并予以提純。該碎片含有包括順序（5889-8349）在內(nèi)的核苷酸編號(hào)為5889至8572的LAV/HTLVⅢ一特有的DNA，所述順序?yàn)長AV/HTLVⅢ膜蛋白質(zhì)的C-末端部分編碼。

將上述1微克碎片與預(yù)先已用限制酶BamHⅠ線性化的0.5微克PGS20DNA混合。在由0.6微克5′-GATCCACCATGGTAC-3′-OH和0.3微克的5′-CATGGTG-3′-OH的低脫氧核苷酸聯(lián)接子存在下，讓這二種碎片的聯(lián)接作用在4℃的溫度中進(jìn)行24小時(shí)。這些聯(lián)結(jié)子用于：（a）將從PRS-3質(zhì)粒DNA中得到的2.68千堿基對(duì)（Kbp）碎片的KpnⅠ粘性末端轉(zhuǎn)化成BamHⅠ粘性末端，后者補(bǔ)償裂開的PGS-20DNA的BamHⅠ粘性末端;（b）在關(guān)于LAV/HTLVⅢ膜基因順序以及轉(zhuǎn)錄的mRNA的有效轉(zhuǎn)譯所需的核苷酸順序的正確讀碼中提供一個(gè)轉(zhuǎn)譯起始順序（ATG）。聯(lián)結(jié)混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株MC1000.對(duì)從α-氨基芐青霉素具有抗藥性轉(zhuǎn)化突變型中得到的質(zhì)粒DNA進(jìn)行插入取向和在聯(lián)結(jié)接點(diǎn)處的BamHⅠ，NcoⅠ和KpnⅠ部位的再生的試驗(yàn)。這種所需要的質(zhì)粒pv-env-2的已確定的結(jié)構(gòu)如圖3，其中相應(yīng)應(yīng)于核苷酸編碼為5889-8572（如圖2所示）的LAV/HTLVⅢ膜基因的羧基編碼部分是位于7.5k牛痘啟動(dòng)區(qū)下方。相對(duì)于DNA聯(lián)結(jié)子所供給的起始ATG而言，LAV/HTLVⅢ膜順序位于正確讀碼上。

6、2、2含有連接在LAV/HTLVⅢenv基因的5′編碼程序上的牛痘病毒啟動(dòng)區(qū)的質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)

5微克PRS-3的質(zhì)粒DNA用AVaⅡ限制酶消化完全，所產(chǎn)生的碎片溶解在1%低熔融溫度的瓊脂糖凝膠中。然后分離出一個(gè)0.82千堿基對(duì)碎片，并予以提純。該碎片含有核苷酸編號(hào)為5671至6490（如圖2所示）的LAV/HTLVⅢ一特有的順序。這包括為膜蛋白質(zhì)中的N-終端部分編碼的順序（核苷酸編號(hào)為5766至6490）和LAV/HTLVⅢ的5′近端未轉(zhuǎn)譯順序的95堿基對(duì)。上述碎片在過量的脫氧核糖核苷酸三磷酸鹽存在下，用Klenow碎片大腸桿菌DNA聚合酶處理。所得的鈍端碎片被聯(lián)結(jié)到0.5微克的PGS20DNA上，后者事先用SmaⅠ線性化，并用小牛腸的堿性磷酸酶（CIAP）處理。聯(lián)結(jié)過程在12℃溫度下進(jìn)行16小時(shí)。聯(lián)結(jié)混合物用于改變大腸桿菌菌株MC1000。對(duì)從α-氨基芐青霉素具有耐藥性轉(zhuǎn)化突變型中得到的質(zhì)粒DNA進(jìn)行有關(guān)痘病毒轉(zhuǎn)錄控制順序的LAV/HTLVⅢ插入取向的試驗(yàn)。所需要的質(zhì)粒pv-env1的以確定的結(jié)構(gòu)示如圖4，其中相應(yīng)于核苷酸編號(hào)5671至6490（如圖2所示）的含有其自身起始ATG的LAV/HTLVⅢ膜基因的氨基編碼部分是位于牛痘7.5k啟動(dòng)區(qū)下方。

6、2、3含有連接在LAV/HTLVⅢenv基因的整個(gè)編碼順序上的牛痘病毒啟動(dòng)區(qū)的質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)

2微克PV-env1的質(zhì)粒DNA用限制酶StuⅠ，PvuⅠ和XhoⅠ完全消化。所產(chǎn)生的碎片溶解在1%低熔融溫度的瓊脂糖凝膠中。pv-env1用StuⅠ和PvuⅠ裂解從而產(chǎn)生2個(gè)4千堿基對(duì)碎片，其中一個(gè)碎片包含LAV/HTLVⅢ的5′部分，另一個(gè)則含有PGS20;而XhoⅠ將含有PGS20的4千堿基對(duì)碎片分裂成較小的碎片，因此后者的能識(shí)別含有牛痘病毒轉(zhuǎn)錄控制成分和LAV/HTLVⅢ膜編碼順序中5′部分的4千堿基對(duì)StuⅠ和PvuⅠ碎片。然后將該碎片進(jìn)行分離、提純和使其聯(lián)結(jié)到由pv-env2的StuⅠ和PvuⅠ限制消化所產(chǎn)生的6.5千堿基對(duì)碎片上。聯(lián)結(jié)混合物用于改變大腸桿菌菌株MC1000。然后選出對(duì)α-氨基芐青霉素具有耐藥性轉(zhuǎn)化突變型。對(duì)從各個(gè)轉(zhuǎn)化突變型中得到的質(zhì)粒DNA試驗(yàn)StuⅠ和PvuⅠ限制部位的再生，以及親本的4千堿基對(duì)和6.5千堿基對(duì)碎片存在與否。圖4示出所需要的質(zhì)粒pv-env5它含有相應(yīng)于核苷酸編號(hào)為5766至8349（如圖2所示）的，從牛痘病毒轉(zhuǎn)錄控制成分下方聯(lián)結(jié)的LAV/HTLVⅢ的整個(gè)外殼基因。

6、2、4含有與缺少穿膜（ANCHOR）順序的LAV/HTLVⅢenv基因相連接的牛痘病毒啟動(dòng)區(qū)的質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)

質(zhì)粒pv-env5（10微克）用HindⅢ完全消化，所產(chǎn)生的碎片溶解在1%低熔融溫度的瓊脂凝膠中。對(duì)含有牛痘7.5啟動(dòng)區(qū)和LAV/HTLVⅢ的env-編碼順序的5′啟動(dòng)區(qū)的3千堿基對(duì)碎片進(jìn)行提純，然后用Klenow酶處理，以插入粘性未端。然后將此碎片聯(lián)結(jié)到業(yè)已用EcoRⅠ消化、接著又依次用Klenow酶和小牛腸的堿性磷酸鹽（CIAP）處理過的多部位克隆的載體（cloningvctor）p26。pv-env5的插入HindⅢ部位和質(zhì)粒p26的插入EcoRⅠ部位的聯(lián)結(jié)作用產(chǎn)生了一個(gè)與env編碼順序同相的終止密碼子。這種中間結(jié)構(gòu)稱為pv-env5/26。

質(zhì)粒pv-env5/26DNA用于改變大腸桿菌MC1000，并加以增強(qiáng)和提純。然后它用BamHⅠ和HPaⅠ將其消化，所產(chǎn)生的碎片溶解在1%瓊脂糖凝膠中。然后對(duì)含有LAV/HTLVⅢ膜編碼順序的2.1千堿基對(duì)碎片進(jìn)行分離，接著再聯(lián)結(jié)到先用BamHⅠ和SmaⅠ消化過的質(zhì)粒PGS20上。所產(chǎn)生的質(zhì)粒pv-env7含有聯(lián)結(jié)到LAV/HTLVⅢ特有順序上的牛痘病毒7.5k啟動(dòng)區(qū)，所述順序從env起始密碼子上方的96個(gè)堿基對(duì)開始，直至核苷酸編號(hào)為7698（圖5）處的HindⅢ部位。因此，該質(zhì)粒缺少所推測(cè)的LAV/HTLVⅢenv基因的錨順序。

6、3含有嵌合的LAV/HTLVⅢenv基因的重組體牛痘病毒的特性和結(jié)構(gòu)

牛痘病毒的兩種親本菌株用于構(gòu)成重組體病毒，即標(biāo)準(zhǔn)研究菌株WR和紐約市衛(wèi)生局所保存的菌株的衍生種V-NY（見6.1.1）。

嵌合的LAV/HTLVⅢenv順序插入到牛痘病毒基因組是通過體內(nèi)重組實(shí)現(xiàn)的，這是由于質(zhì)粒pv-env2，pv-env5和PV-env7的嵌合基因側(cè)面與胸苷激酶（TK）基因的牛痘病毒順序密碼相接才使之成為可能。將這些質(zhì)粒引入被牛痘病毒感染的細(xì)胞之中能使質(zhì)粒上的TK順序和牛痘病毒基因的相同順序之間發(fā)生重組。嵌合基因的插入是由于在側(cè)翼順序中的雙重組的結(jié)果。這類重組體將具有插入牛痘TK基因中的嵌合基因，因此，在表現(xiàn)型上是TK-。這些TK重組體能被選出使其在添加BUdR的培養(yǎng)基中生長，其中BUdR對(duì)TK+細(xì)胞是致死的，但對(duì)TK-細(xì)胞無致死作用。此法的一般原理已有報(bào)道（Mackett，M.，Smith，G.L.andMoss，B.，1984.J.Virol.49，857-864）

6、3、1含有嵌合LAV/HTLVⅢenv基因的重組體牛痘病毒的結(jié)構(gòu)

一只100毫米大小的盤子盛有80%匯集的非洲綠猴腎細(xì)胞（BSC40株）用牛痘病毒（WR菌株）感染，其中感染復(fù)數(shù)（mol）為0.05。在37℃下培養(yǎng)2至4小時(shí)后，用質(zhì)粒pv-env2或pv-env5的DNA的酸鈣的共沉淀物覆蓋感染細(xì)胞。這些沉淀物是通過將0.5毫升2ZXDNA0-CaCl2溶液逐滴加入0.5毫升2XHeBS溶液中來制備的（ZXDNA-CaCl2溶液是將20微克質(zhì)粒DNA溶于濃度為0.25克分子/升的0.5毫升氯化鎢溶液中組成;每毫升2×HeBS溶液中含有16毫克氯化鈉，0.74毫克氯化鉀，0.25毫克的磷酸氫鈉的二水合物，2毫克葡萄糖和10毫克HEPES，PH為7.08）。在室溫下放置30分鐘以形成DNA-磷酸鈣共沉淀物。沉淀被覆蓋4小時(shí)后，細(xì)胞用1×HeBS清洗一次，然后在2毫升15%甘油的1×HeBS溶液中培養(yǎng)3分鐘，溫度為37℃，接著再用1×HeBS清洗一次，再用10毫升生長培養(yǎng)基（DMEM+10%小牛胚胎血清+100單位/毫升青霉素+100單位/毫升鏈霉素）培養(yǎng)。兩天后，得到感染細(xì)胞，并用離心分離法收集（4℃，在2000×g離心10分鐘）。病毒原材料的制備方法是將這些細(xì)胞重新懸浮在1毫升PBSAM中，然后進(jìn)行二次凍結(jié)和融化循環(huán)，接著再進(jìn)行三次15秒的聲處理。

重組體是按下述方法精選：使稀釋度為10-3的0.1毫升上述病毒原材料溶液沉積在60毫米盤子盛有匯集的人體143TK細(xì)胞，用5毫升含有下列成分的DMEM溶液覆蓋（以每盤計(jì)）：1%Nobel瓊脂（Difco，Detroit，MICH），5%小牛血清，25微克DMEM/毫升BUdR。經(jīng)過二天沉積后，細(xì)胞通過覆蓋2毫升（以每盤計(jì)）含有如上述同樣拼料的瓊脂培養(yǎng)基對(duì)其染色，其中所述培養(yǎng)基內(nèi)除添加0.01%中性紅外，其他成份均與前述相同。染色后第一天收集各斑塊，并使其重新懸浮在0.5毫升PBSAM中，取出一整份的病毒懸浮液（0.25毫升），用于在選擇的培養(yǎng)基（DMEM+10%小牛胚胎血清+100單位/毫升青霉素+100單位/毫升鏈霉素+25微克/毫升BUdR）中感染接種在直徑為16毫米管內(nèi)的匯集得到的143TK-細(xì)胞。感染細(xì)胞是通過離心分離予以收集，然后再懸浮在含有0.5毫克/毫升胰蛋白酶和0.2毫克/毫升乙二胺四乙酸（EDTA）的100微升PBS溶液中。細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)30分鐘使其溶解，然后進(jìn)行三次聲處理，每次20秒。采用多管式過濾岐管;使細(xì)胞溶解產(chǎn)物收集在硝化纖維素過濾器上（SchleicherandSchuell，Arlington，MA）。通過DNA-DNA雜交（參見Mackett，M.，Smith，G.L和Moss，B.，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.79，7415-7419）可確定這些樣品中是否存在LAV/HTLVⅢenv特有的DNA順序。采用斷口轉(zhuǎn)譯（nick-translation）所制備的用磷-32標(biāo)記的質(zhì)粒PRS-3DNA被用作雜交探針。對(duì)所述雜交探針有正雜交作用的重組體在選擇性條件下（含有BUdR的培養(yǎng)基）在143TK-細(xì)胞上再進(jìn)行斑塊提純兩次，然后又在非選擇性條件下，在BSC-40細(xì)胞上提純一次。最后由DNA-DNA雜交證實(shí)后，取BSC-40細(xì)胞上三次提純斑塊制備病毒原材料，并將其用于以后的特征記述。

重組體病毒的結(jié)構(gòu)示意圖如圖6所示，圖中用于牛痘7.5k啟動(dòng)區(qū)（p→）下方的LAV/HTLVⅢ膜基因順序（env）側(cè)面與牛痘基因組內(nèi)的TKDNA順序相接。從中痘病毒基因組和質(zhì)粒pv-env5之間重組得到的病毒制原材料稱為v-env5，它包含完整的LAV/HTLVⅢ膜基因。在此處實(shí)施例所描述的具體實(shí)施方法中，v-env5含有全部的膜基因以及5-近端未轉(zhuǎn)譯順序的96個(gè)堿基對(duì)和3′-近端未轉(zhuǎn)譯順序的223個(gè)堿基對(duì)。從pv-env2中得到的病毒原材料稱為v-env2，它包含大部分的LAV/HTLVⅢ膜基因（即KpnⅠ碎片），但缺少用于為LAV/HTLVⅢ膜蛋白質(zhì)的起始的42個(gè)氨基酸編碼的部分順序。由于LAV/HTLVⅢ膜蛋白質(zhì)的推測(cè)的信號(hào)順序是位于所述蛋白質(zhì)中起始的49個(gè)氨基酸內(nèi)，則v-env2應(yīng)當(dāng)產(chǎn)生一種不具有信號(hào)順序的蛋白質(zhì)，因此可以預(yù)期由所述重組體病毒產(chǎn)生的與LAV/HTLVⅢ相關(guān)的蛋白質(zhì)不會(huì)輸送成膜。與此相反，包含完整的LAV/HTLVⅢenv順序的v-env5應(yīng)當(dāng)產(chǎn)生一種能輸送到膜的蛋白質(zhì)。從pv-env7中得到的病毒原材料稱為env7，它包含LAV/HTLVⅢenv膜基因的整個(gè)N-末端，但缺少HindⅢ部位下方的順序。由于此結(jié)構(gòu)中沒有所推測(cè)的穿膜（錨）順序，人們會(huì)預(yù)期由所述重組體所產(chǎn)生的與LAV/HTLVⅢ相關(guān)的蛋白質(zhì)被分沁進(jìn)入生長培養(yǎng)基中。這種性質(zhì)是有利于該種蛋白質(zhì)的提純，以使用其作診斷試劑或用于作為亞單元疫苗的配方

6、3、2牛痘LAV/HTLVⅢ膜重組體的限制膜式

分別從親本牛痘病毒株WR和V-NY，以及它們的衍生種v-env5和v-env5NY中得到DNA是按業(yè)已描述的方法進(jìn)行分離（Espositoetal，1981，J，Virol.Methods，2∶175-180），它們限制酶HindⅢ對(duì)其進(jìn)行消化，所產(chǎn)生的碎片溶在0.7%瓊脂糖凝膠中。由親本株WR中得到的DNA顯示典型的限制模式（圖2A），與以前描述的相同（Defilippes，1982，J.Virol.43∶136-149）.v-NY的限制模式是相似的，但與WR的模式有區(qū)別。最明顯的差別是HindⅢB和C碎片的長度方面，這些碎片是牛痘病毒基因組的末端碎片。重組體v-env5和v-env5NY沒有它們親本株的HindⅢJ碎片;取而代之的是觀察到兩個(gè)新碎片，大小分別為5.4千堿基對(duì)和3.2千堿基對(duì)。這一發(fā)現(xiàn)是與將LAV/HTLVⅢ膜編碼順序插入位于HindⅢJ碎片的牛痘TK基因的雙重組過程的結(jié)果一致。由于在LAV/HTLV順序中存在一個(gè)HindⅢ部位，所以通過插入產(chǎn)生兩個(gè)碎片。這一結(jié)果也證實(shí)了相對(duì)于牛痘病TK基因的LAV/HTLVⅢ插入的取位。

6、3、3牛痘LAV/HTLVⅢ膜重組體的Southernbolt分析

由Southernblot分析證實(shí)了在重組病毒基因組的限制消化過程中產(chǎn)生的兩個(gè)新的HindⅢ碎片的同一性。如同圖7A所示一樣溶解在瓊脂糖凝膠的DNA碎片被轉(zhuǎn)移到消化纖維素過濾器中，然后雜交到為LAV/HTLVⅢ外殼順序的斷口轉(zhuǎn)譯探子上。如圖7B所示，僅在5.4.和3.2千堿基對(duì)碎片中發(fā)現(xiàn)雜交作用。這一結(jié)果證實(shí)了圖6所示的重組體病毒的基因組結(jié)構(gòu)。

6、4被重組體牛痘病毒感染的組織培養(yǎng)物細(xì)胞中與LAV/HTLVⅢ膜有關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)。

攜帶嵌合的LAV/HTLVⅢenv基因的重組體牛痘病毒已證明能在組織培養(yǎng)物中的細(xì)胞感染表達(dá)與LAV/HTLVⅢ膜相關(guān)的蛋白質(zhì)。此外，還發(fā)現(xiàn)這是些蛋白質(zhì)可與愛滋病人的血清進(jìn)行免疫反應(yīng)。

6、4、1利用免疫斑塊法鑒別被重組體牛痘病毒感染的細(xì)胞表達(dá)的與LAV/HTLVⅢ外殼有關(guān)的蛋白質(zhì)

一只100毫米盤子盛有匯集的BSC-40細(xì)胞使其受到野生型牛痘病毒或其重組體衍生種v-env5或v-env2感染，感染復(fù)數(shù)為10。感染過程進(jìn)行12小時(shí)。在12小時(shí)時(shí)則要收獲細(xì)胞，然后用PBS清洗一次，再進(jìn)行離心分離。接著再將感染的細(xì)胞小丸懸浮在1毫升Laemmli樣品緩沖液中（Laemmli，V.K，1970，nature227∶680），加熱沸騰4小時(shí)以使其溶解。一整份75微升細(xì)胞溶解液中的全部細(xì)胞蛋白質(zhì)，產(chǎn)生電泳法，使之分解在7-15%的梯度SDS-聚丙烯酰胺凝膠中。此外，用一個(gè)已被提純過的LAV/HTLVⅢ病毒粒子樣品和一份模擬的感染細(xì)胞溶解液作為對(duì)照組。凝膠的內(nèi)含物質(zhì)依靠電輸送移入硝化纖維素過濾器上。然后先將過濾器在5毫升含有5%無脂奶粉（牛奶）的PBS溶液中培養(yǎng)30分鐘，溫度為室溫，然后在由PBS、5%無脂奶粉和取自愛滋病人的血清（熱的滅活血清1∶1000的稀釋度）組成的，溫度也為室溫的溶液中繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)。接著過濾器用含有0.05%吐溫20（聚氧化乙烯山犁醇甘油一月桂酸酯）的PBS溶液將過濾器清洗5次，之后再用單獨(dú)的PBS溶液清洗一次。清洗后的過濾器在室溫下用5毫升含有1%正常山羊血清（熱的滅活血清），并加有1∶3000稀釋度的山羊抗人體免疫球蛋白一辣根過氧化物酶共軛物的PBS溶液培養(yǎng)2小時(shí)。所述的過濾器再用含有0.05%吐溫20的PBS溶液清洗5次，接著又用TBS（0，5MNaCl+20mMTris-PHCl，PH7.5）清洗一次。結(jié)合在過濾器上的辣根過氧化物酶共軛物可用下述方法檢測(cè)：使氯萘酚著色試劑與過濾器在暗處作用10分鐘，溫度為室溫（氯萘酚著色試劑是在使用前將A、B二種溶液混合來制備的，其中溶液A的組成為：20毫升30%冷甲醇+60毫克4氯-1-萘酚;溶液B為：60微升30%冷過氧化氫+100毫升TBS）。粘在過濾器上的，與愛滋病人血清中抗體發(fā)生反應(yīng)的蛋白質(zhì)可通過結(jié)合在山羊抗人體免疫球蛋白辣根過氧化物酶共軛物上的著色試劑來檢測(cè)。

這一分析結(jié)果示如圖8A，圖中表明牛痘病毒重組體v-env5產(chǎn)生了一個(gè)包含三種蛋白質(zhì)的族，其中所述的蛋白質(zhì)能夠特異性地與愛滋病人的血清起免疫反應(yīng)。而且這類蛋白質(zhì)的電泳泳動(dòng)度類似于被認(rèn)為是由env基因編碼的真正LAV/HTLVⅢ糖蛋白質(zhì)gp150，gp110和gp41（Robey，W.G.etal.，1985，Science228∶593-595）。在模擬的感染細(xì)胞或野生型牛痘病毒感染的細(xì)胞中均未產(chǎn)生這些蛋白質(zhì)。缺少5′近端順序的重組體v-env2產(chǎn)生縮短了的蛋白質(zhì)，但仍然可與愛滋病人血清起免疫反應(yīng)，其中所提到5′近端順序是為LAV/HTLVⅢ膜蛋白質(zhì)的推測(cè)的起始蛋氨酸和最初的42個(gè)氨基酸起編碼作用。據(jù)推測(cè)，重組體v-env2中的env程序的轉(zhuǎn)譯起始于從在該重組體結(jié)構(gòu)中所用的聯(lián)結(jié)子順序轉(zhuǎn)錄的AUG密碼子（參見下文）。

在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，兩個(gè)細(xì)胞系（BSC-40和Hela）用v-env5和v-env2感染。在感染細(xì)胞溶解產(chǎn)物中的LAV/HTLVⅢ特有蛋白質(zhì)是按下述的western免疫污斑法測(cè)定。

匯集的單層BSC-40或Hela細(xì)胞用重組體v-env5或v-env2感染，感染復(fù)數(shù)（moi）為每個(gè)細(xì)胞50個(gè)斑塊成形單位。感染后12小時(shí)，細(xì)胞用磷酸緩沖的鹽水清洗二次，然后再懸浮在Laemmli樣品緩沖液中，加熱類沸5分鐘。感染細(xì)胞中的蛋白質(zhì)用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯胺（SDS-PAGE）電泳分解，依靠電輸送移入硝化纖維素膜上，再使之與取自LAV/HTLVⅢ/血清陽性的個(gè)體的混合血清起反應(yīng)。按照氯胺T法（按照制造商的說明書）用碘-125標(biāo)記（Amersham，MA）的蛋白質(zhì)A可用于檢測(cè)能起免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)。在圖8B中，通道1和5包含取自模擬感染細(xì)胞的蛋白質(zhì);通道2和6包含取自野生型牛痘病毒感染細(xì)胞的蛋白質(zhì);通道3和7包含來自V-env5感染細(xì)胞的蛋白質(zhì);通道4和8包含來自V-env2感染細(xì)胞的蛋白質(zhì)。經(jīng)苷糖梯度提純的LAV/HTLVⅢ病毒粒子蛋白質(zhì)用作對(duì)照組（LAV/HTLVⅢ）;膜蛋白質(zhì)gp150，gp110和gp41的位置均如圖所示。分子量標(biāo)準(zhǔn)用千道爾頓表示（KD）。

在v-env5感染的細(xì)胞中，可以檢測(cè)到與取自血清陽性個(gè)體的混合血清起免疫反應(yīng)的三種主要蛋白質(zhì)（圖8B中通道3和7）。經(jīng)計(jì)算，這些蛋白質(zhì)的分子量為150KD，120KD和41KD，與LAV/HTLVⅢ膜糖蛋白質(zhì)gp150，gp110和gp41的分子量相似。

重組體病毒v-env2缺少LAV/HTLVⅢenv的公認(rèn)的信號(hào)順序，但至少能產(chǎn)生三種分子量分別為99KD，68KD和40KD的能起免疫反應(yīng)的多肽（見圖8中通道4和8）。

6、4、2利用免疫沉淀法鑒別被重組體牛痘病毒感染的細(xì)胞表達(dá)的與LAV/HTLVⅢ膜有關(guān)的蛋白質(zhì)

以下所描述的免疫沉淀測(cè)定證明，被本發(fā)明的重組體牛痘病毒感染的細(xì)胞能合成可特異地與愛滋病病人的血清發(fā)生免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)。

一只100毫米盤子盛有匯集的BSC-40細(xì)胞，使其受到野生型牛痘病毒，或其重組體v-env5，或者v-env2感染，感染復(fù)數(shù)為10。在9.5小時(shí)后感染時(shí)，用無蛋氨酸的不補(bǔ)充血清DMEM更換生長培養(yǎng)基，感染后10小時(shí)，用2毫升含有100微克/毫升的[35S]-蛋氨酸的無蛋氨酸DMEM替換上述培養(yǎng)基，并使這一放射性標(biāo)記過程在37℃溫度下進(jìn)行2小時(shí)。在標(biāo)記過程結(jié)束時(shí)，細(xì)胞用PBS清洗一次，然后用離心法收集。將細(xì)胞丸懸浮在1毫升具有下述成分的溶解緩沖液中：1%NP-40（聚氧乙烯（9）P-tart辛基酚），0.5%脫氧膽酸鈉.0.1MaCl，0.01MTris-HCl，PH7.4和1mMEDTA，再將細(xì)胞溶解產(chǎn)物用Eppendort微型離心機(jī)離心分離1分鐘，使之澄清。

將取自對(duì)照人群或愛滋病人的5微升熱滅活的人血清加到100微升的細(xì)胞溶解產(chǎn)物中，以進(jìn)行免疫沉淀。在4℃下培養(yǎng)1小時(shí)后，加入60微升活化的金色葡萄糖球菌細(xì)胞（PansorbinCellCalbiochem-BehiringCorp.，LaJolla，（A），在4℃下繼續(xù)培養(yǎng)1小時(shí)。然后用Eppendorf微型離心機(jī)離心分離30秒，以收集免疫沉淀復(fù)合物，溫度為4℃，接著用含有1MNaCl，0.1%NP-40，0.01MTris-HCl和PH為7.4的溶液清洗1次，再用RIPA緩沖液[10mMTris-HCl，PH7.2，0.15MNaCl，1%脫氧膽酸鈉，1%Triton×100（聚氧乙烯（9-10）P-tart辛基酚），0.1%十二烷基硫酸鈉）。經(jīng)過洗滌的免疫沉淀物再次被懸浮在50微升的Llaemmli樣品緩沖液中，加熱沸騰1分鐘，然后用Eppendorb微型離心機(jī)進(jìn)行1分鐘的分離。留在上層清液中的免疫沉淀后的蛋白質(zhì)在15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分析。電泳后，用考馬斯籃色染料對(duì)凝膠染色，接著用水揚(yáng)酸鈉處理（在室溫下用1M水揚(yáng)酸鈉處理30分鐘），干燥后進(jìn)行熒光照相。

這一分析結(jié)果如圖9所示，它表明重組體v-env5合成能特異地與愛滋病病人血清發(fā)生免疫反應(yīng)的一族蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)的表觀分子量為160，140，120，42和40千道爾頓（KD），大致與業(yè)已報(bào)道的LAV/HTLVⅢ的與外殼相關(guān)的糖蛋白質(zhì)的表觀分子量相符（Robey，W.G.etal.，1985，Science228∶593-595）.這類蛋白質(zhì)既不存在于模擬感染細(xì)胞或野生型牛痘病毒感染細(xì)胞中，也不會(huì)被對(duì)照人體血清免疫沉淀。在v-env2感染細(xì)胞中，產(chǎn)生了一種表觀分子量為95KD的去掉末端的蛋白質(zhì)，并為愛滋病病人血清所識(shí)別。這種去掉末端的LAV/HTLVⅢenv有關(guān)的蛋白質(zhì)很可能起始于由聯(lián)接子順序編碼的AUG密碼子，所述聯(lián)結(jié)子順序位于該重組體內(nèi)LAV/HTLVⅢ插入物的5′近端。

6、4、3牛痘-LAV/HTLVⅢ重組體病毒產(chǎn)生的與LAV/HTLVⅢ外殼有關(guān)的氚-葡糖胺

下面描述的射免疫沉淀測(cè)定表明，本發(fā)明的牛痘-LAV/HTLVⅢ重組體病毒可產(chǎn)生糖基化膜蛋白質(zhì)。

Hela細(xì)胞或被摸擬感染（見圖9B，通道1和5），或分別被野生型牛痘病毒（通道2和6），重組體v-env5（通道3和7）或v-env2（通道4和8）感染，感染復(fù)數(shù)均為50pfu/細(xì)胞。感染后4至16小時(shí)內(nèi)，將氚-葡糖胺（濃度為23微居/毫克，共計(jì)0.25微居，Amersham）加到培養(yǎng)基中。細(xì)胞用磷酸鹽緩沖的鹽水洗滌2次，然看在含有0.1MNaCl，0.01MTris-HCl，PH7.4，1mMEDTA，1%NP-40（聚氧乙烯（9）P-tart-辛基酚）和0.5%脫氧膽酸鈉的緩沖液中溶解。取出幾份細(xì)胞溶解產(chǎn)物，或?qū)⑵渑c正常人體血清（通道1-4）或與來自LAV/HTLVⅢ血清陽性的個(gè)體（通道5-8）中的混合血清進(jìn)行混合。然后免疫反應(yīng)蛋白質(zhì)用帶有蛋白質(zhì)A的固定金色葡萄糖球菌細(xì)胞沉淀，接著用SDS-PAGE溶解，并用熒光照相檢測(cè)。

用葡萄糖胺放射性同位素標(biāo)記結(jié)果如圖9B的通道7所示，它表明用v-env5重組體制得的蛋白質(zhì)就像LAV/HTLVⅢ外殼蛋白質(zhì)一樣，也發(fā)生了糖基化。糖基化模式的區(qū)別可用以解釋由重組體得到的蛋白質(zhì)與LAV/HTLVⅢ病毒粒子糖蛋白質(zhì)之間電泳泳度的細(xì)微差異。

正如從缺少信號(hào)肽的蛋白質(zhì)可以預(yù)計(jì)的那樣，在V-env2感染細(xì)胞中未觀察到具有氚-葡萄糖胺的N連接的糖基化（圖9B，通道8）。

6、4、4牛痘-LAV/HTLVⅢ重組體病毒產(chǎn)生的與LAV/HTLVⅢ膜有關(guān)的脈沖-追蹤免疫沉淀

有人提出，LAV/HTLVⅢ的gp150是一種前體，從所述的這種前體可得到外部的蛋白質(zhì)gp110和穿膜蛋白質(zhì)gp41。以下描述的“脈沖-跟蹤”免疫沉淀測(cè)定表明從牛痘-LAV/HTLVⅢ重組體制造的分子量分別為150KD，120KD和41KD蛋白質(zhì)具有一種與公認(rèn)的LAV/HTLVⅢ的gp150，gp110和gp41所提出的相類似的前體-產(chǎn)物關(guān)系。

匯集的單層Hela細(xì)胞分別用野生型牛痘病毒（見圖9C，通道1-6），重組體V-env5（通道7-12），或V-env2（通道13-18）感染，感染復(fù)數(shù)均為50Pfu細(xì)胞。在10.5小時(shí)感染后，對(duì)細(xì)胞用100微居/毫升的35S-蛋氨酸（大于800居里/毫克分子，Amersham）標(biāo)記15分鐘。接著用2毫升預(yù)先溫?zé)岬母櫯囵B(yǎng)基（Dulbecco改進(jìn)的伊格爾培養(yǎng)基+3毫克/毫升L-蛋氨酸+5%小牛血清+100單位/毫升青霉素+100微克/毫升鏈霉素）洗滌一次，再加1毫升相同的培養(yǎng)基，然后回到培養(yǎng)器中。在6、4、3段中，在不同的時(shí)間，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌和溶解，而細(xì)胞溶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)用來自LAV/HTLVⅢ血清陽性個(gè)體的混合血清進(jìn)行免疫沉淀。免疫沉淀的蛋白質(zhì)再用SDS-PAGE溶解，并用熒光照相檢測(cè)。每次跟蹤持續(xù)時(shí)間如下：0小時(shí)（通道1，7，13）;0.5小時(shí)（通道2，8，14）;1小時(shí)（通道3，9，15）;2小時(shí)（通道4，10，16）;6小時(shí)（通道5，11，17）和12小時(shí)（通道6，12，18）。結(jié)果如圖9C所示，通道7-12表示由重組體制得的分子量分別為150KD，120KD和41KD的蛋白質(zhì)，其前體一產(chǎn)物關(guān)系與公認(rèn)的LAV/HTLVⅢgp150，gp110和gp41的前體一產(chǎn)物關(guān)系一致。在Hela細(xì)胞中，150KD蛋白質(zhì)的處理顯得慢和效率低，因?yàn)槊}沖-標(biāo)記六小時(shí)，150KD蛋白質(zhì)中不到50%的放射性被跟蹤到120KD和41KD蛋白質(zhì)。初步結(jié)果表明，這種處理在用同樣重組體病毒感染的某些類型的人體外周血細(xì)胞中更有效。這些實(shí)驗(yàn)也表明，缺少公認(rèn)的LAV/HTLVⅢenv的信號(hào)順序的env-2中的env順序可表達(dá)為一個(gè)未經(jīng)改進(jìn)的87KD前體（780氨基酸），后者被處理成為一個(gè)99KD中間體，并裂成68和40KD多肽（圖9C，通道13-18）。

6、4、5被牛痘-LAV/HTLVⅢ重組體病毒感染的細(xì)胞的生長培養(yǎng)基中與LAV/HTLVⅢ膜有關(guān)的蛋白質(zhì)的存在

以下描述的放射免疫沉淀測(cè)定證明，本發(fā)明的由重組體牛痘病毒產(chǎn)生的有免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)能用一個(gè)類似于公認(rèn)的LAV/HTLVⅢ外殼糖蛋白的模式來表達(dá)和處理。

匯集的單層Hela細(xì)胞或用模擬感染（見圖9D，通道1），或分別用野生型牛痘病毒（通道2），重組體V-env5（通道3）或V-env2（通道4）感染，感染復(fù)數(shù)均為20Pfu/細(xì)胞。細(xì)胞感染后用濃度為100微居/毫升的35S-蛋氨酸（大于800居里/毫克分子，Amersham）標(biāo)記10至12小時(shí)。標(biāo)記結(jié)束時(shí)接著除去培養(yǎng)基，在12，000×g下離心分離2分鐘，進(jìn)行澄清，然后用來自LAV/HTLVⅢ血清陽性的個(gè)體的混合血清進(jìn)行免疫沉淀。用同樣血清進(jìn)行免疫沉淀的感染細(xì)胞的蛋白質(zhì)顯示在以“丸”（Pellet）標(biāo)記的板上，而從培養(yǎng)基中得到的蛋白質(zhì)則顯示以在用“Supe”標(biāo)記的板上。

正如對(duì)LAV/HTLVⅢ的gp110所預(yù)期的那樣，由重組體制造的120KD蛋白質(zhì)也在感染的細(xì)胞培養(yǎng)基中檢出（圖9D，通道3）。這些結(jié)果證明，重組體病毒V-env5能夠表達(dá)LAV/HTLVⅢenv基因，并能產(chǎn)生有免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)，后者按一個(gè)類似于公認(rèn)的LAV/HTLVⅢ外殼糖蛋白的膜式被進(jìn)行處理。

也正如對(duì)缺少信號(hào)肽的蛋白質(zhì)所預(yù)期的那樣，在V-env2感染的細(xì)胞培養(yǎng)基中未檢出與LAV/HTLVⅢ外殼有關(guān)的多肽（圖9D，通道4）。

另一方面，受V-env7感染的細(xì)胞表達(dá)一種分子量為130KD的去掉末端的蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì)缺少含有LAV/HTLVⅢ外殼蛋白質(zhì)的錨順序的C-末端217氨基酸。這種去掉末端的蛋白質(zhì)（gp130）被分泌在生長培養(yǎng)基中，較之gp110或其前體gp150（圖9E）有效得多。同時(shí)，gp130未被有效地處理成gp110，既使裂開部位仍存在于去掉末端的分子中。

6、5LAV/HTLVⅢenv牛痘重組體病毒的免疫效力。

攜帶嵌合的LAV/HTLVⅢenv基因的重組體病毒已被證明能夠誘發(fā)二種品系小鼠和一種低于人類的靈長類對(duì)付LAV/HTLVⅢ的抗體反應(yīng)。

6.5.1在小鼠中牛痘LAV/HTLVⅢenv牛痘重組體的免疫效力。

對(duì)于由重組體牛痘病毒V-env5和V-env2表達(dá)的蛋白質(zhì)的免疫原性進(jìn)行鑒定。下述實(shí)驗(yàn)表明，這些重組體病毒誘發(fā)對(duì)LAV/HTLVⅢ所有主要糖蛋白的免疫應(yīng)答的能力。

二種品系小鼠，其中一種是近交系（C57B16J），另一種為遠(yuǎn)交系（ICR），都用重組體病毒V-env2或V-env5接種。所有動(dòng)物在接種時(shí)都已5-7周齡。采用的是下列四種接種方式：爪墊接種，尾巴劃痕接種，鼻內(nèi)接種和腹膜內(nèi)接種。其中爪墊接種是在每只老鼠后爪墊注入25微升（5×106Pfu）重組體病毒;尾巴劃痕接種則是用一根分叉針將尾巴底部的皮膚摩擦，然后在劃破的表面注入10微升（2×107Pfu）重組體病毒放在鼠鼻中，讓老鼠吸入接種物。至于腹膜內(nèi)注射，是將10微升（2×107Pfu）重組體病毒注入小鼠的腹膜腔中。所有病毒原材料和稀釋劑均按6.1.方法制備。接種后每隔兩周采集兩只小鼠的血清樣品，并用下面描述的與酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法（ELISA）和西方污斑分析法進(jìn)行分析測(cè)定。

6.5.1.1由酶聯(lián)免疫吸附劑證明的用牛痘-LAV/HTLVⅢenv重組體免疫的小鼠之血清轉(zhuǎn)化。

6周血清樣品的酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定數(shù)據(jù)歸納成表1。C57B16J小鼠的重組體V-env2和V-env5血清轉(zhuǎn)化率分別為100%和95%。而對(duì)于ICR小鼠而言，其中V-env2血清轉(zhuǎn)化率為44%;而V-env5則為100%。在通過尾部劃痕方法免疫的小鼠中可以得到完全血清轉(zhuǎn)化率以及酶聯(lián)免疫吸附劑效價(jià)的平均值最高。

表1用攜帶嵌合的LAV/HTLVⅢenv基因的重組體病毒接種的小鼠血清轉(zhuǎn)化率＊

接種后小鼠血清轉(zhuǎn)化率

重組病毒接種方式ICRC57B16J

V-env2爪墊接種3/34/5

尾巴劃痕接種3/34/5

鼻內(nèi)接種0/34/5

腹膜內(nèi)接種未做3/5

V-env5爪墊接種4/45/5

尾巴劃痕接種3/35/5

鼻內(nèi)接種3/34/5

腹膜內(nèi)接種未做5/5

＊血清轉(zhuǎn)化按下文中所描述的酶聯(lián)免疫吸附劑法測(cè)定，以各組血清轉(zhuǎn)化的老鼠數(shù)與組內(nèi)接種小鼠總數(shù)之比表示。

ELISA數(shù)據(jù)用下述方法得到：業(yè)已提純和滅活的LAV/HTLVⅢ病毒粒子用碳酸鹽緩沖劑（50nm碳酸鈉，PH9.6）稀釋，然后加到96-井微滴板（100微升/井，每個(gè)井含有0.2微克滅活的LAV/HTLVⅢ）。在4℃溫度下放置過液，以使結(jié)合過程得以進(jìn)行。將未結(jié)合的蛋白質(zhì)抽出，每個(gè)井先用含有5%無脂奶粉的200微升PBS溶液洗滌，然后再用300微升的4%蔗糖溶液洗滌。將過量的蔗糖溶液抽出，使培養(yǎng)板在室溫下干燥（1小時(shí)）。然后再將50微升含有2.5微升小鼠血清樣品的PBS溶液加到每個(gè)井中，使之在37℃下反應(yīng)1小時(shí)。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，用含有0.05%吐溫-20（聚氧乙烯山犁醇甘油-月硅酸酯）的PBS溶液洗井5次。再將50微升的山羊的抗鼠辣根一過氧化物酶共軛物（PBS+0.05%吐溫-20的溶液進(jìn)行1∶5000的稀釋）加到每個(gè)井中，使之在37℃下反應(yīng)45分鐘。在用含有0.05%吐溫-20的PBS溶液洗5次后，加入100微升檸檬酸-O-苯二胺一過氧化物底物。底物如下過程制備：將0.294克鈉的二水合物和0.537克磷酸氫鈉晶體（SodiumPhosphatDibasiCrystal）溶于10毫升水中，用鹽酸將PH值調(diào)節(jié)至5.0;在使用前當(dāng)即加入2微升30%過氧化氫和4毫克O-苯二胺。培養(yǎng)板在室溫下放在暗處培養(yǎng)30分鐘。然后在每個(gè)井中加入100微升濃度為1.3當(dāng)量的硫酸，使反應(yīng)停止，并在490毫微米處測(cè)定反應(yīng)混合物的吸光度。

表1的結(jié)果以血清陽性的老鼠數(shù)與受接種的老鼠總數(shù)之比。接種后6周收集血清樣品，用ELISA對(duì)其進(jìn)行分析。5只接種小鼠的血清樣品用作對(duì)照組。對(duì)照組的平均ELISA效價(jià)對(duì)于ICR和C57B16J小老鼠而言分別為0.021±0.05和0.017±0.010取自受免疫接種的小鼠的血清樣品的ELISA效價(jià)較之對(duì)照組高三個(gè)以上標(biāo)準(zhǔn)離差，這些血清樣品被評(píng)價(jià)為陽性。

6.5.1.2經(jīng)血清轉(zhuǎn)化的小鼠產(chǎn)生對(duì)付公認(rèn)的LAV/HTLVⅢ外殼糖蛋白的抗體是通過免疫污斑測(cè)定證明的。

為了證明用重組體病毒接種的小鼠是否產(chǎn)生對(duì)付公認(rèn)的LAV/HTLVⅢ外殼糖蛋白的抗體，取自免疫接種小鼠的血清樣品是按下述西方免疫污斑法測(cè)定的：5至7周齡近交系的雄性小鼠（C57B16J，Jackson實(shí)驗(yàn)室）是通過尾部劃痕進(jìn)行免疫接種，即在尾巴底部被分叉針劃破處施入10微升內(nèi)含2×107Pfu重組體牛痘病毒的接種物。在接種后8周，在動(dòng)物后眼眶竇道放血，并將血漿保持冷凍狀態(tài)，直至使用為止。取出幾份血清樣品，加入0.2%NP-40和30%無脂奶粉，用磷酸鹽緩沖鹽水稀釋50倍，然后使之與LAV/HTLVⅢ病毒粒子蛋白質(zhì)反應(yīng)，后者已被SDS-PAGE溶解，并通過電轉(zhuǎn)移法固定在硝化纖維素濾紙上。被這些血清識(shí)別的LAV/HTLVⅢ蛋白質(zhì)是用與堿性磷酸酶共軛的山羊的抗小鼠免疫球蛋白來檢測(cè)。

在尾部劃痕處用重組體病毒接種的C57B16J組的小鼠身上所取的8周血清樣品的結(jié)果示于圖10。所有用重組體病毒接種的動(dòng)物均產(chǎn)生能與LAV/HTLVⅢ外殼糖蛋白gp41發(fā)生反應(yīng)的抗體。某些用V-env5（圖10，通道a）免疫接種的動(dòng)物，其血清也能識(shí)別gp150和gp110，這就表明，所述的重組體病毒能夠誘發(fā)對(duì)付LAV/HTLVⅢ所有主要糖蛋白的免疫應(yīng)答。

6.5.2在低于人的靈長類中牛痘-LAV/HTLVⅢ重組體V-env5的免疫原性。

在兩種低于人的靈長類物種彌猴（Macacafascicularies）和黑猩猩中，對(duì)牛痘-LAV/HTLVⅢ重組體V-env5的免疫原性進(jìn)行了研究：以下各小節(jié)所描述的結(jié)果證明，V-env5能夠在所述的二個(gè)物種誘發(fā)體液參與和細(xì)胞參與的免疫性。

6.5.2.1用V-env5免疫接種的彌猴的體液應(yīng)答

9只長尾巴獼猴，包括幼獼猴至成年獼猴，用于研究牛痘-LAV/HTLVⅢ重組體V-env5的免疫原性。事先對(duì)所所有動(dòng)物都作了普查，以確證其體內(nèi)沒有對(duì)付牛痘病毒和LAV/HTLVⅢ的抗體，也不存在猴的T-親淋巴性病毒或猴的愛滋病病毒，以及對(duì)付這些病毒的抗體。四只猴子用2×108pfu的V-env5接種，另外四只則接種2×710pfu的相同病毒。此外，還有一只動(dòng)物接種2×107pfu劑量的對(duì)照重組體牛痘病毒（牛痘-皰疹單純性gDI）重組體V-HSgDI）。所有動(dòng)物均用皮膏劃痕接種。接種前，以及接種后的第4、第6和第8周采集血清和肝素化了的血樣品。在首次接種后經(jīng)過十周，再對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行第二次接種，所用的病毒與上次相同，劑量為2×10pfu。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，所有動(dòng)物都顯現(xiàn)出典型疫苗感染的自愈合皮膚損傷和正常的生理指征。采用ELISA和西方污斑測(cè)定法分析體液應(yīng)答。

為了作ELISA分析，血清試樣要用含有3%無脂奶粉和0.2%NP40（聚氧乙烯（9）P-tert-辛基酚）的PBS溶液稀釋50倍，然后使之與已固定在微滴井中的LAV/HTLVⅢ病毒粒子蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。除所用的第二種抗體是與辣根過氧物酶共軛合的山羊抗人體抗體外，此處的ELISA操作步驟與66.5.1.1節(jié)中所描述的相同。

圖11所示的結(jié)果證明第二次免疫接種后所有動(dòng)物都被血清轉(zhuǎn)化，盡量在第一次接種后只有兩只動(dòng)物已血清轉(zhuǎn)化。

為確證受過免疫接種的動(dòng)物產(chǎn)生什么抗體，第二次免疫接種后4周所采集的血清試樣用西方污斑法進(jìn)行分析。對(duì)于二種外殼糖蛋白gp41和gp110的最佳檢測(cè)采用二種方案。為了最佳檢測(cè)gp41，血清用加有30%未施行巴斯德氏消毒的牛奶和0.2%NP-40的PBS溶液稀釋50倍，然后在室溫下與固定在硝化纖維素濾紙上的已被提純的LAV/HTLVⅢ病毒粒子蛋白質(zhì)反應(yīng)1小時(shí)。接著濾紙用加有0.2%NP-40的PBS溶液洗滌，再用加有0.2%NP-40的PBS緩沖稀釋2000倍，并使之和與堿性磷酸酶其軛的山羊抗人體免疫球蛋白抗體（Zymed，CA）進(jìn)行反應(yīng)。而為了檢測(cè)gp110，血清用加有3%未施行巴斯德氏消毒的牛奶的PBS溶液稀釋50倍，然后在室溫下與固定在硝化纖維濾紙上的已被提純的LAV/HTLVⅢ病毒粒子蛋白質(zhì)反應(yīng)1小時(shí)。接著濾紙用加有0.01%吐溫-20的PBS溶液洗滌，再用PBS緩沖液稀釋2000倍，并使之和與堿性磷酸酶其軛的山羊抗人體免疫蛋白抗體（Zymed，CA）反應(yīng)。以上任一方法中，第二次抗體反應(yīng)后的最終洗滌均使用含有0.1克分子濃度Tris（PH9.5），0.1克分子濃度氯化鈉和5毫克分子濃度氯化鎂溶液。與濾紙上抗原上結(jié)合的抗體是按下述方法檢測(cè)：使濾紙與含有0.1克分子濃度Tris（PH9.5），0.1克分子濃度氯化鈉，5毫克分子濃度氯化鎂，0.33毫克/毫升溴-氯-吲哚荃磷酸鹽和0.17毫克/毫升硝基藍(lán)四唑鎓溶液發(fā)生反應(yīng)。在濾紙與上述色原反應(yīng)完畢，接著用水清洗，再經(jīng)空氣中干燥后進(jìn)行照相。

如圖12B所示，所有受到二次接種的動(dòng)物對(duì)gp41都顯現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)。另外，其中四個(gè)動(dòng)物還產(chǎn)生與gp110進(jìn)行強(qiáng)烈反應(yīng)的抗體。總之，圖12A所示的結(jié)果證明了重組體V-env5能夠誘發(fā)獼猴產(chǎn)生LAV/HTLVⅢ外殼特有的抗體。

6.5.2.2在用V-env5免疫接種的獼猴的細(xì)胞傳參與的免疫應(yīng)答

采用Ficoll-hypaque離心分離法，從第二次真皮內(nèi)免疫接種后4周所得到的獼猴肝素化的血中分離外周血淋巴細(xì)胞（PBL），其中第二次接種所用的接種物或是V-env5，或者是對(duì)照的牛痘重組體病毒表達(dá)的單純性皰癥病毒糖蛋白D（V-HSVgdl）。從僅用V-env5接種一次的獼猴81以及從未受免疫接種的獼猴血中也分離出外周血淋巴細(xì)胞。這些外周血淋巴細(xì)胞懸浮在補(bǔ)充有10%熱的滅活正常人體血清的RPMI1640培養(yǎng)基中（GIBCO，Grand島，紐約），然后在最后體積為0.1毫升的培養(yǎng)基中取出1×105外周血淋巴細(xì)胞，將其放入96井圓底培養(yǎng)板的井內(nèi)。每個(gè)井內(nèi)加入0.1毫升含有紫外（UV）光滅活的V-env5（在紫外光滅活前為1×10pfu/毫升），或未受破壞的LAV/HTLVⅢ（1毫克/毫升，約為1×105TCID50）的培養(yǎng)基，其中LAV/HTLVⅢ是采用兩次蔗糖梯度離心，從LAV/HTLVⅢ感染的CEM細(xì)胞的上層清液提純得到，而所述的CEM細(xì)胞是屬于HLADR陰性T細(xì)胞白血病系。刺激后六天，每只井PBL用1微居的氚-TdR（氚-胸苷，NewEnglandNuclear，Boston，MA）標(biāo)記6小時(shí)，然后取出細(xì)胞，測(cè)定氚-TdR的Cpm（居里/分C），由此可得到4只相同的實(shí)驗(yàn)井的平均值。將結(jié)合進(jìn)被刺激細(xì)胞的cpm，氚-TdR除以結(jié)合進(jìn)未受刺激細(xì)胞的cpm，即可計(jì)算出刺激指數(shù)。

表2

用牛痘重組體病毒表達(dá)的LAV/HTLVⅢ外殼糖蛋白對(duì)獼猴進(jìn)行免疫接種后所得的PBL的LAV/HTLVⅢ誘發(fā)的增生反應(yīng)

用于對(duì)PBL刺激的病毒

獼猴免疫未用病毒LAV/HTLVⅢV-env5

編號(hào)接種cpm＊cpm＊SI＊cpm＊SI＊

67V-env51.5867.4654.760.41538.1

68V-env52.2459.0754.028.63812.8

74V-env51.5854.7323.021.48713.6

75V-env55818.64514.937.84714.1

76V-env52.4795.9872.536.65714.8

80V-env51.07713.92212.924.75223.0

81V-env59653.9854.140.57242.0

82V-env52.5818.5803.346.84718.1

73V-HS

VgD16125531.0-56.21791.9

26無2.9111.8221.0-2.2401.0-

27無1.2281.0721.0-2.5322.0

＊結(jié)合進(jìn)的cpm3H-TdR

＊＊刺激指數(shù)

如表2所示，所有受過免疫接種的獼猴，包括僅接受一次V-env5接種81號(hào)獼猴，都產(chǎn)生一些淋巴細(xì)胞，它們的體外對(duì)LAV/HTLVⅢ刺激有專門反應(yīng)而增殖。與此相反，接受過牛痘一單純性皰診病毒重組體V-HSVgDI的73號(hào)獼猴，其淋巴細(xì)胞僅對(duì)牛痘病毒刺激有反應(yīng)而對(duì)LAV/HTLVⅢ刺激無反應(yīng)。作為對(duì)照的未受免疫接種的獼猴不產(chǎn)生能對(duì)上述任一抗原作反應(yīng)的淋巴細(xì)胞。而且，用V-env5進(jìn)行免疫接種的獼猴，其淋巴細(xì)胞的反應(yīng)在大小上與用V-HSVgDI接種的73號(hào)獼猴相同。這些結(jié)果表明，通過在獼猴中的重組體病毒表達(dá)LAV/HTLVⅢenv基因不會(huì)抑制在體外或體內(nèi)T細(xì)胞參與的免疫反應(yīng)。

為確定受過免疫接種的獼猴哪一部分淋巴細(xì)胞可受到LAV/HTLVⅢ刺激，特用二個(gè)顯色免疫熒光檢查受刺激的PBL以了解的存在于活化的T細(xì)胞或B細(xì)胞的IL-2受體的表現(xiàn)。CD4和CD8抗原是存在于T細(xì)胞之中，而CD20（Bp35）抗原是存在于B細(xì)胞之中。表3所示結(jié)果證明，幾乎所有表達(dá)為IL-2受體的被病毒刺激的PBL也表達(dá)CD4或CD8抗原，而有1.5%至2%共同表達(dá)CD20（Bp35）抗原。這一結(jié)果表明受刺激的淋巴細(xì)胞是T細(xì)胞。

表3

從用LAV/HTLVⅢ或重組體牛痘病毒表達(dá)的LAV/HTLVⅢ外殼糖蛋白刺激接種的獼猴所得到的PBL上的IL-2受體和CD4，CD8或CD20（Bp35）抗原的表達(dá)

IL-2R+細(xì)%IL-2R+細(xì)胞

獼猴刺激PBL胞的總的共同表達(dá)

編號(hào)的病毒%CD4CD9CD20（Bp35）

74V-env527.748.652.22.0

80V-env25.662.440.0NT

74LAV/HTLVⅢ14.750.059.01.9

80LAV/HTLVⅢ12.058.038.01.5

80無病毒0.30.3-0.3-0.3-

表3中結(jié)果是由以下方式得到：PBL同時(shí)用對(duì)白細(xì)胞間素-2受體（IL-2R）的藻紅蛋白共軛的單克隆抗體2A3（Becton-Dickinson，Inc.，MountainView，CA）進(jìn)行染色，和CD20的與熒光素共軛的單克隆抗體1F5（GeneticSystemsCorpSeattie，WA）進(jìn)行染色，和用對(duì)CD8的G10-1（GeneticSystemsCorpSeattle，WA）進(jìn)行染色，或者用對(duì)CD4的T4a（OrthoDiagnostics，Baritan，N.J.）進(jìn)行染色。所用的抗體飽和濃度，是通過對(duì)用帶有改進(jìn)的FACSⅢ分揀器的流動(dòng)顯微熒光計(jì)分析的淋巴細(xì)胞進(jìn)行滴定所確定（Becton-Dickinson，MountainView，CA）。二色定量分析按以前描述的方法進(jìn)行（Ledbetter，J.A.，etal.，1984，PerspectivesinImmunogeneticsandHistcompatibility，6，119-129）。對(duì)前方位角和直角的散射門調(diào)整到包括淋巴母細(xì)胞和大量小淋巴細(xì)胞。所顯示的數(shù)值是IL-2R+細(xì)胞總的百分?jǐn)?shù)，以及IL-2R+細(xì)胞表達(dá)CD4，CD8或CD20（Bp35）的百分?jǐn)?shù)。

已經(jīng)證實(shí)T細(xì)胞受到抗原刺激后，產(chǎn)生了包括IL-2的淋巴激活素，而IL-2能促進(jìn)T細(xì)胞和B細(xì)胞分化和/或增生，并能活化天然的殺傷細(xì)胞，殺傷細(xì)胞能溶解受包括愛滋病毒在內(nèi)的各種病毒感染的細(xì)胞。因此我們要了解接受接種獼猴的T細(xì)胞在用LAV/HTLVⅢ刺激后是否產(chǎn)生IL-2？

為此進(jìn)行了二個(gè)實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)1中，從第二次用V-env5或由WR牛痘病毒株構(gòu)成的V-HSVgDI進(jìn)行真皮內(nèi)接種4周的獼猴的肝素化血內(nèi)分離出PBL。而在實(shí)驗(yàn)2中，從第一次用2×105pfu的V-env5，V-HSVgDI或V-env5重組體病毒進(jìn)行真皮內(nèi)接種4周后的獼猴肝素化血內(nèi)分離出PBL，其中所述的重組體病毒是由紐約衛(wèi)生局的疫苗病毒株（V-env5NY）構(gòu)成。使PBL懸浮在添加10%熱滅活的正常人體血清的1640培養(yǎng)基中，再將2×105PBL放入96井圓底培養(yǎng)皿的井中。然后在井內(nèi)加入紫外光滅活的V-env5（在紫外光滅活前為1×106pfu/毫升或被提純過的LAV/HTLVⅢ（1微克/毫升）。刺激后二天，從同樣的井中得到上層清液，并驗(yàn)證它們支持IL-2相關(guān)CTI-2細(xì)胞（由S.Gillis博士提供，ImmunexCorp.，Seattle，WA）的增生能力，所以測(cè)定前要洗滌24小時(shí)，以除去IL-2。在用上層清液培養(yǎng)的最后6小時(shí)期間，讓細(xì)胞用3H-TdR標(biāo)記），然后測(cè)定結(jié)合進(jìn)細(xì)胞的3H-TdR的量。通過試驗(yàn)人體IL-2重組體（由Gillis博士提供）對(duì)CTLL-2細(xì)胞增殖的影響所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可計(jì)算出上層清液中存在的IL-2活性單位。表Ⅲ列出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表4

用LAV/HTLVⅢ或重組體牛痘病毒表達(dá)的受接種獼猴血中PBL用LAV/HTLVⅢ愛滋病病毒外殼糖蛋白刺激后的接種或用表現(xiàn)為AIDS病毒外殼糖蛋白的重組體獼猴的PBL所產(chǎn)生的IL-2

實(shí)驗(yàn)1：上層清液中的IL-2（單位/毫升）

獼猴免疫刺激PBL的病毒

編號(hào)接種無病毒LAV/HTLVⅢV-env5

67V-env5028.096.5

68V-env5016.0124.0

74V-env509.052.0

73V-HSVgDI00188.0

26無000

實(shí)驗(yàn)2：

03V-env5014.455.8

05V-env5NY016.833.3

49V-env5NY07.126.7

52V-env5NY02.427.6

59V-HSVgDI0027.6

26無000

27無000

表4中的實(shí)驗(yàn)1的結(jié)果表明，受V-env5免疫接種兩次的獼猴血中得到的PBL，又經(jīng)V-env5或LAV/HTLVⅢ刺激后，其上層清液含有IL-2，這是為它們能夠誘發(fā)CTLL-2增生所證實(shí)，后者是一種IL-2相關(guān)的細(xì)胞系。同樣，如表Ⅲ的實(shí)驗(yàn)2所示，受V-env5免疫接種一次的編號(hào)為03獼猴，以及用同樣重組體（V-env5NY，見6.3節(jié)）的“牛痘苗”菌株進(jìn)行一次免疫接種的所有三只獼猴，所取出的經(jīng)LAV/HTLVⅢ或V-env5刺激的PBL，在其上層清液中檢測(cè)出IL-2。與此相比，從受牛痘-HSVgD-1重組體病毒免疫接種的編號(hào)為73和59的獼猴所取的PBL僅在用V-env5刺激后才產(chǎn)生IL-2，而用LAV/HTLVⅢ刺激后并未產(chǎn)生IL-2。此外，編號(hào)為26和27的未受免疫接種的獼猴，經(jīng)LAV/HTLVⅢ或重組體牛痘病毒刺激后均不產(chǎn)生可檢出量的IL-2。由于首先是帶有輔助/誘導(dǎo)活性的T細(xì)胞在受到抗原刺激后才產(chǎn)生IL-2，則這些結(jié)果證明，受重組體病毒免疫接種的獼猴中確實(shí)存在輔助T細(xì)胞，后者能識(shí)別LAV/HTLVⅢ。除了這些產(chǎn)生IL-2的T細(xì)胞在B細(xì)胞分化產(chǎn)生對(duì)付LAV/HTLVⅢ外殼抗原的抗體的一可能作用外，在效應(yīng)細(xì)胞（如能殺死感染細(xì)胞的病毒對(duì)細(xì)胞有毒性的T淋巴細(xì)胞或天然殺傷細(xì)胞）的分化和/或擴(kuò)張過程中可能涉及到這些產(chǎn)生IL-2的T細(xì)胞。

6.5.2.3受V-ENV5NY免疫接種的黑猩猩的體液應(yīng)答

二只幼小的黑猩猩接受屬于V-env5疫苗株的V-env5NY的真皮內(nèi)接種，接種物劑量為5×108pfu。一只動(dòng)物接受同樣效價(jià)的牛痘單純性皰癥病毒gD重組體，即V-HSVgDINY的真皮接種，后者由相同親本牛痘菌株（V-NY）如V-env5NY構(gòu)成。第一次免疫接種后8周，所有動(dòng)物均接受第二次接種，劑量同前。免疫接種后每隔兩周采集一次血清樣品，并用ELISA和西方污斑法測(cè)定LAV/HTLVⅢ特有的抗體，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，所有動(dòng)物都顯現(xiàn)出牛痘病毒感染典型的自愈合皮膚損傷，以及具有正常的生理指征。

對(duì)黑猩猩血清用的ELISA方法是與獼猴血清所用的相同。表Ⅴ所示的結(jié)果表明，兩只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（124和149）自第一次免疫接種后8周，已發(fā)生血清轉(zhuǎn)化，經(jīng)接受第二次免疫接種后其抗體水平繼續(xù)升高。對(duì)照動(dòng)物（134）保持血清陰性。

表5

接受重組體牛痘病毒免疫接種的黑猩猩的血清樣品的ELISA分析結(jié)果LAV/HTLVⅢ-特有血清抗體的ELISA讀數(shù)

取樣134號(hào)黑猩猩124號(hào)黑猩猩149號(hào)黑猩猩

時(shí)間V-HSVgDINYV-env5NYV-env5NY

預(yù)先抽血0.084±0.0150.100+0.0050.123+0.025

第一次接

種后8周0.085±0.0100.185±0.0200.403±0.027

第二次接

種后2周0.075±0.0120.237±0.0170.523±0.073

為驗(yàn)證在受過免疫接種動(dòng)物中檢出的LAV/HTLVⅢ特異的抗體是對(duì)準(zhǔn)外殼糖蛋白的，特用西方污斑對(duì)同樣的血清作了分析。所用的方法最適于gp41抗體，而且與獼猴血清分析所用的相同。圖13所示的結(jié)果證明，這二只接種過的動(dòng)物所產(chǎn)生的LAV/HTLVⅢ特異的抗體確實(shí)是對(duì)準(zhǔn)膜糖蛋白，而且這些抗體水平在第二次免疫接種后升高。

6.5.2.4接受V-env5NY免疫接種的黑猩猩的細(xì)胞參與的免疫應(yīng)答

以6.5.2.3節(jié)所描述的同樣動(dòng)物血中分離出的外周血淋巴細(xì)胞（PBL）被用于驗(yàn)證這些動(dòng)物的細(xì)胞參與的免疫應(yīng)答。自第一次用重組牛痘病毒進(jìn)行真皮內(nèi)接種后4周，通過Eicoll-hypaque離心分離，從肝素化血中分離出PBL。然后將PBL接種在96井培養(yǎng)皿內(nèi)的加有10%熱滅活的正常人體血清和青霉素/鏈霉素的RPMI140培養(yǎng)基內(nèi)，其中每只井含有1×10細(xì)胞。接著在井中加入未受破壞的LAV/HTLVⅢ（5微克/毫升）或LAV/HTLVⅢ外殼糖蛋白（1微克/毫升），后者是用晶狀體植物凝血素層析法從已提純的LAV/HTLVⅢ分離的。六天后，用液體閃爍計(jì)數(shù)法測(cè)定結(jié)合在細(xì)胞中的氚-胸苷。

如表4所示，受V-env5NY免疫接種的二只動(dòng)物（124和149）的淋巴細(xì)胞隨LAV/HTLVⅢ病毒粒子或提純的膜蛋白（env）刺激作用而增生。與之相比，接受牛痘-單線性皰疹病毒重組體V-HSgDINY接種的134號(hào)動(dòng)物不產(chǎn)生能識(shí)別LAV/HTLVⅢ的淋巴細(xì)胞。

表6

用牛痘組體接種的黑猩猩的細(xì)胞參與的免疫應(yīng)答

接合進(jìn)PBL的氚-胸苷

黑猩猩刺激的病毒

編號(hào)免疫接種無抗原LAV/HTLVⅢenv

124V-env5NY248237，13226，370

149V-env5NY37520，29227，115

134V-env5NY3671，987367

64無452567222

72無7372，417905

所有黑猩猩的PBL經(jīng)受植物血凝素（PHA，2微克/毫升）或X-射線輻照后的人體混合異種的PBL刺激后，均顯視出高水平的氚-胸苷結(jié)合，其數(shù)值分別為38，870至109，790cpm和42，172至12，067cpm。接受V-env5或V-HSVgDINY免疫接種的黑猩猩，其PBL顯視出對(duì)牛痘病毒有強(qiáng)烈的增生反應(yīng);而未受免疫接種的黑猩猩的PBL不隨牛痘病毒的刺激而增生?？傊恝?Ⅵ和圖11-13所示的結(jié)果表明，（a）重組體牛痘病毒V-env5及其在疫苗菌株中的對(duì)應(yīng)物V-env5NY能夠在獼猴和黑猩猩這兩種次于人的靈長類動(dòng)物中誘發(fā)LAV/HTLVⅢ特異的體液和細(xì)胞參與的免疫應(yīng)答;（b）重組體病毒不會(huì)抑制體外或體內(nèi)T細(xì)胞參與的免疫應(yīng)答。

6.6由牛痘病毒的V-NY株構(gòu)成的重組體的神經(jīng)毒性減低

將若干份25至50微升含有5×10pfu病毒注入5只老鼠大腦內(nèi)，接種后10天計(jì)算其死亡率。

表3的結(jié)果表明，由斑塊提純的組織培養(yǎng)物得到的疫苗病毒（V-NY菌株）及其衍生種V-env5NY和V-env2NY和V-env7NY與WR菌株及其衍生種相比，它們的神經(jīng)毒性降低。由于紐約市衛(wèi)生局的菌株被用作天花疫苗，因此建立在這種菌株基礎(chǔ)上得到的重組體更適于研制人體用的疫苗。

表7

大腦內(nèi)接種牛痘重組體的小鼠死亡率

接種死亡鼠數(shù)/接受注射鼠數(shù)

V-NY0/5

V-env5NY0/5

V-env2NY0/5

V-env7NY0/5

天花疫苗（Wyeth）3/5

V-env55/5

V-env25/5

V-env75/5

鹽水0/5

7.實(shí)施例：桿狀病毒gag重組體

在以下各實(shí)施例中，將各種質(zhì)粒載體制成含有嵌合基因的這些嵌合基因包括位于AcNPV轉(zhuǎn)錄控制順序下方的LAV/HTLVⅢgag編碼順序。

這些包含AcNPV多角體啟動(dòng)區(qū)和LAV/HTLVⅢgag編碼順序的嵌合基因通過體內(nèi)重組被插入AcNPV基因組中。對(duì)這類重組體病毒進(jìn)行鑒別和提純，并從感染組織培養(yǎng)細(xì)胞中制備病毒原材料。起免疫反應(yīng)的、與LAV/HTLVⅢgag相關(guān)的蛋白質(zhì)已被證明系由重組體AcNPV在體外產(chǎn)生。受重組體病毒的細(xì)胞被證明能顯示出正免疫熒光。最后，從用重組體AcNPV感染的細(xì)胞溶解產(chǎn)物，若用愛滋病人的血清處理時(shí)，則在ELISA測(cè)定中呈陽性。本發(fā)明的該實(shí)施例的每一步驟的詳細(xì)說明見下述各小節(jié)。

7.1一般方法

7.1.1細(xì)胞和病毒

Spodoterafrugiperda細(xì)胞，無性繁殖系sf9是從美國典型培養(yǎng)物收集品（ATCCNo.CRL1711）中得到，并使之在Grace′sAntheraea培養(yǎng)基（Gibco，KCBiologicals）中繁殖，培養(yǎng)基含有3.3克/升的yeastolate（Difco）和3.3克/升的乳清蛋白水解產(chǎn)物（Difco），10%牛胚胎血清，以及0.06克/升青霉素和0.1克/升鏈霉素（TNM-FH培養(yǎng)基）。細(xì)胞在28℃溫度中生長。Autographacalifonica核多角體病毒系從LoisMiller博士處得到（DepartmentofGeneticsandEntomology，UniversityofGeorgia，Athens，GA30602），并在含有1%瓊脂糖和0.8×TNM-FH的sf9細(xì)胞上進(jìn)行斑塊提純。病毒原材料用TNM-FH進(jìn)行稀釋。

7.1.2DNA制備、限制和改進(jìn)

限制酶是從Bethesda研究實(shí)驗(yàn)室購得，限制消化的條件是按制造商建議。將大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow碎片以濃度為200單位/毫升放入含有50mMTris-HCl（PH7.5）6mMMgCl2和10mM2-巰基乙醇的溶液之中，溫度37℃，時(shí)間30分鐘。

用于轉(zhuǎn)染的病毒DNA是利用下述Miller，L.K.，MillerD.W和Safer，P.的方法，從野生型病毒的非閉合病毒（NOV）原材料中制得。通過墊料液含有25%蔗糖、5mMNaCl和10mMEDTA，在90，000xg溫度5℃離心分離1小時(shí)將上層清液的NOV粒子制成小丸。將上層清液移去，再使病毒懸浮在0.5毫升溶解緩沖液中（10mMTris，PH7.6，10mMEDTA，0.25%SDS）。在病毒粒子再度懸浮后，加入蛋白酶K，使最終濃度為500微克/毫升，并培養(yǎng)過夜（大約16小時(shí)），溫度為37℃，且不時(shí)攪拌。然后用相同體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）組成的溶液萃取DNA。然后DNA通過加入1/10體積的PH為5的3M醋酸鈉和2個(gè)體積的冷乙醇在-20℃下沉淀出來。在成粒后，DNA用70%乙醇洗滌，干燥，而在用于轉(zhuǎn)染或限制酶分析之前懸浮在TE（10mMTris，1mMEDTA，PH7.5）之中。質(zhì)粒DNA是用下述Summers，M.D和Smith，G.E的最佳制備方法來制備的：一毫升加有適當(dāng)抗菌素的Luria液體培養(yǎng)基（LB）是取自剛制備的培養(yǎng)皿中的菌落細(xì)菌細(xì)胞接種。在37℃下培養(yǎng)12至18小時(shí)后再將1毫升培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到盛有200毫升加有抗菌素的LB的5000-1000毫升燒瓶中，接著將其放入搖動(dòng)恒溫器內(nèi)（37℃）過夜（12-18小時(shí)）。將200毫升培養(yǎng)物移入離心機(jī)瓶內(nèi)以2500轉(zhuǎn)/分進(jìn)行離心分離10分鐘。移出上層清液后，讓每個(gè)細(xì)胞小丸在室溫下重新懸浮在30°毫升STET緩沖液（8%蔗糖、0.5TritonX-100，50mMEDTA（PH8.0）10mMTris-Cl，PH8.0），并再移入125毫升燒瓶中。每只瓶內(nèi)加入3毫升濃度為10毫克/毫升的溶菌酶（在STET緩沖液中新鮮制備），并旋動(dòng)瓶子使之混合，在室溫下培養(yǎng)5分鐘。接下來將每只瓶子直接放在火焰上輕輕旋動(dòng)，直至細(xì)胞開始凝固并轉(zhuǎn)成白色。一俟氣泡形成，就將燒瓶移入沸水浴中，放置45秒鐘，然后再將此瓶放入冰水浴中冷卻2分鐘或更長些。此后將上述粘滯的混合物慢慢倒入50毫升圓底離心瓶中，在一只用SW28轉(zhuǎn)子（Beckman，CA）的制備離心機(jī)中離心分離15分鐘，轉(zhuǎn)速為16000轉(zhuǎn)/分。各管內(nèi)上層清液仔細(xì)傾入50毫升活動(dòng)的聚丙烯離心管中，管內(nèi)還加入1個(gè)體積的異丙醇或2個(gè)體積乙醇，DNA在-80℃沉淀20分鐘（或-20℃下沉淀2小時(shí)或更長些），然后在2500×9條件下離心15分鐘或更長些。移去乙醇后，在小丸中加入2.5毫升萃取緩沖液（每升緩沖液中含有12.1克Tris，33.6克Na2EDTA2H2O和14.9克KCl，PH為7.5），并將其旋轉(zhuǎn)，以松動(dòng)瓶底細(xì)胞溶解產(chǎn)物。接著加入10微升濃度為10毫克/毫升，RNaseA（溶解在0.1×TE中，沸騰10分鐘以進(jìn)行預(yù)處理），在37℃下培養(yǎng)30分鐘。再在各管內(nèi)加入約為200微克的蛋白酶K，并在45℃-50℃下培養(yǎng)30分鐘，在這時(shí)加入250微升10%Sarkosyl，繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)或更長時(shí)間。為了制備氯化銫梯度，各管內(nèi)加入濃度為10毫克/毫升的溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓，以每毫升DNA溶液計(jì)的用量為80微升。然后再在每只管內(nèi)加入1.04克氯化銫/毫升DNA溶液，隨即輕輕旋動(dòng)使其溶解。在轉(zhuǎn)子中進(jìn)行離心分離后，即在70.1Ti固定角轉(zhuǎn)子中進(jìn)行離心分離以達(dá)到平衡，轉(zhuǎn)速為55，000轉(zhuǎn)/分，時(shí)間16小時(shí)，由此產(chǎn)生二個(gè)截然分開的可見的DNA帶，其中上部的帶包括直線的切口DNA。而下部帶內(nèi)含有共價(jià)鍵封閉的環(huán)狀DNA。取出下部的帶（以共價(jià)鍵封閉的環(huán)狀DNA），放入15毫升聚乙烯離心管中，再加水使各管體積達(dá)到6毫升。用等體積異戊醇從DNA中萃取出溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓，上部粉紅色液相取出并倒掉。萃取過程需重復(fù)進(jìn)行;直至上部液相成為無色，而底部（DNA）液相為清澈無色。此時(shí)，各管內(nèi)應(yīng)當(dāng)留有5毫升DNA溶液（若不到此毫升數(shù)，則應(yīng)加水至5毫升），然后加入2個(gè)體積無水乙醇。將其在-20℃下放置過夜，或在-80℃放置10分鐘，使DNA沉淀析出。接著在2，500×g下成粒20分鐘。除去所有乙醇后，再向每個(gè)小丸加入50微升0.1×TE，并使之在65℃下再次懸浮10分鐘或更長時(shí)間。DNA能在4℃下保存。

質(zhì)粒DNA也按Maniatis等所描述的方法制備：[（MolecularCloning，ColdSpringHarborLaboratory（PP.8696）]。DNA連接酶是從NewEnglandBiolabs購進(jìn)，使用時(shí)加入50mMTris-HCl（PH7.8），10mMMgCl2，20mMDTT，1mMATP，使DNA濃度為10，000單位/毫升。在瓊脂凝膠中的DNA分析是按下述ManiatiS等所提供的方法進(jìn)行（1982，MolecularCloning，ColdSpringHarborLaboratory）。

7.2含有聯(lián)結(jié)到LAV/HTLVⅢgag基因（PAC-gag1）的編碼順序的AcNPV啟動(dòng)區(qū)的質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)

下述各小節(jié)描述含有LAV/HTLVⅢgag基因編碼順序的質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)，其中所述的基因位于AcNPV轉(zhuǎn)錄控制程序之后，但位于多角體DNA之前。這些重組體質(zhì)粒載體以后用于將LAV/HTLVⅢgag編碼順序通過體內(nèi)重組插入桿狀病毒的基因組。

在以下各小節(jié)中，LAV/HTLVⅢgag編碼順序（圖14）是從PKS-5中進(jìn)行提純，后者是λJ19的亞無性繁殖系（Wain-Hobson，S.，et.al，1985，Cell40∶9），并被插入pAC610中所包含的桿狀病毒的多角體啟動(dòng)區(qū)下方的質(zhì)粒Ac610之中，以構(gòu)成PAC-gagⅠ（圖15）。在這一結(jié)構(gòu)中，LAV/HTLVⅢ特異的核苷酸順序位于多角體基因順序前面的多角體啟動(dòng)區(qū)形成一個(gè)嵌合基因之前。

如前所述，PKS-5是由λJ19中所包含的LAV/HTLVⅢDNA插入物的一個(gè)3，148堿基對(duì)SstⅠ至KpnⅠ的碎片組成的、其中λJ19克隆進(jìn)PUC18的SstⅠ和KpnⅠ部位。它是通過將J19的SstⅠ限制碎片克隆進(jìn)PUC18的SstⅠ部位，以創(chuàng)造PBT-1，后者用KpnⅠ消化后再進(jìn)行聯(lián)接。這種DNA用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并分離出質(zhì)粒PKS-5。PKS-5所包含的LAV/HTLVⅢ特異的DNA位于LAV/HTLVⅢ基因組中從位于核苷酸224的SstⅠ部位至位于核苷酸3372的KpnⅠ部位（Wain-Hobson，S.etal.，1985，Cell40∶9;也可看圖14）。

10微克PKS-5用Hincll和SstⅠ消化完全，產(chǎn)生的碎片再溶解在1%低熔融溫度瓊脂糖凝膠中。將1818堿基對(duì)碎片（約為0.20微克）從凝膠中除去。該碎片包含圖14所示的從核苷酸編號(hào)224至2042的LAV/HTLVⅢ特有的順序。它包括整個(gè)gag基因編碼區(qū)。

5微克PAc610用SmaⅠ和SstⅠ消化至完全，然后在1%低熔融瓊脂糖凝膠上分級(jí);DNA帶（約0.4微克）從凝膠中除去（圖15）。

兩塊凝膠片在65℃下熔化10分鐘，而3微升的1818堿基對(duì)LAV/HTLVⅢ特有碎片（用HincllSstⅠ消化）聯(lián)結(jié)到1微升的PAc610（用SmaⅠ和SstⅠ消化）中，總體積40微升。然后在23℃（室溫下）培養(yǎng)16小時(shí)，然后這種聯(lián)結(jié)的混合物在65℃下加熱10分鐘，用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌株HB101。對(duì)于從對(duì)氨基芐青霉素有耐藥性轉(zhuǎn)化實(shí)變型取出的質(zhì)粒DNA進(jìn)行試驗(yàn)，從確定是否存在LAV/HTLVⅢ插入體。這一質(zhì)粒PAc-gag的結(jié)構(gòu)示于圖15。

7.3含有嵌合的LAV/HTLVⅢgag基因（Ac-gag1）的重組體桿狀病毒的結(jié)構(gòu)

AcNPV是用斑塊法提純，在Sf9細(xì)胞上繁殖。按前面描述的方法將野生型AcNPVDNA進(jìn)行分離以及PAc-gag1提純（見7.1.2節(jié)）。

由于PAc-gag1的gag順序側(cè)向是與ACNPV編碼順序相接，因此使得要通過體內(nèi)重組來實(shí)現(xiàn)將嵌合的LAV/HTLVⅢgag基因插入AcNPV基因組成為可能。PAc-gag1質(zhì)粒DNA與野生型AcNPVDNA共同轉(zhuǎn)染可以使該質(zhì)粒的多角體順序和AcNPV基因組的同種順序之間發(fā)生重組。嵌合基因的插入是由于側(cè)翼順序重組的結(jié)果。這類重組體將具有插入AcNPV多角體基因的嵌合基因，因此不能產(chǎn)生閉合體（occlusionbodg）。通過目視檢查缺少閉合體病毒可以選出重組體斑塊。

將1微克1AcNPVDNA，5微克PAc-gag1和15微克小牛胸腺DNA進(jìn)行混合和用乙醇沉淀。所得沉淀物用70%乙醇洗滌，然后放在組織培養(yǎng)通風(fēng)罩下進(jìn)行空氣干燥，接著再使之懸浮在437微升水中，并加入0.25M氯化鋁（將63微升的2MCaCl2加到437微升的DNA水溶液中）。在使空氣鼓包通過500微升2×HEBS同時(shí)，逐滴加入DNA溶液（每4秒鐘一滴）。每毫升2×HEBS中含有16毫克NaCl，2毫克1D-葡萄糖，0.75毫克氯化鉀和0.5毫克NaHPO·12HO等，PH為7.1）。該混合物在室溫下培養(yǎng)30分鐘，然后倒入一只60毫米的組織培養(yǎng)皿，此培養(yǎng)皿盛有2毫升包含10%牛胎盤血清（FBS）和抗生素（無Yestolate或乳清蛋白水解產(chǎn)物）的Grace′s昆蟲培養(yǎng)基，其中含有3×106Sf9細(xì)胞。接著將DNA溶液逐滴加入細(xì)胞中，培養(yǎng)皿在28℃下培養(yǎng)4小時(shí)。以后再用含有FBS和抗菌素的4毫升Grace′s培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行洗滌，再在含有FBS，抗菌素和20%二甲亞砜的Grace′s培養(yǎng)基中培養(yǎng)90秒種。

培養(yǎng)平皿用完全培養(yǎng)基洗滌三次，再在28℃下用4毫升完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。5天后，收集上層清液，在1000×g條件下澄清5分鐘。在Sf9細(xì)胞上對(duì)病毒原材料進(jìn)行滴定，用目視檢查辨認(rèn)非閉合的斑塊，然后將非閉合斑塊檢出，再成斑兩次。這些斑塊在Sf9細(xì)胞上擴(kuò)張，制成病毒原材料以供以后特征記述之用，圖16為重組體結(jié)構(gòu)示意圖。

7.4用重組體桿狀病毒感染的組織培養(yǎng)細(xì)胞中的與LAV/HTLVⅢgag相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)

攜帶嵌合LAV/HTLVⅢgag基因的重組體AcNPV被證明能夠在組織培養(yǎng)物的感染細(xì)胞上表達(dá)與LAV/HTLVⅢgag有關(guān)的RNA和蛋白質(zhì)。這些也被發(fā)現(xiàn)是能與愛滋病人的血清發(fā)生免疫反應(yīng)。

7.4.1受Ac-gag1感染的細(xì)胞中的LAV/HTLVⅢgag特異的RNA的鑒別

將十只盛有Sf9細(xì)胞（每只培養(yǎng)皿約有107細(xì)胞）的100毫米培養(yǎng)皿用野生型AcPNV或其重組體，Ac-gag1感染，感染復(fù)數(shù)為4。感染后24小時(shí)取出細(xì)胞，用含有0.01MTris-HClPH為7.2的0.15MNacl洗滌兩次。再按有關(guān)文獻(xiàn)介紹的方法分離多腺苷酸化的RNA（Purchio，A.F.andFareed，G，G.，1979，J.Virol.29∶763-769）。接著使RNA在1%瓊脂糖-甲醛凝膠中分級(jí)（Lehrach，H.，etal.，1979，Biochemistry16∶4743-4251），而后轉(zhuǎn)入尼龍過濾器（Hubond）并用紫外光照射。使該過濾器與含有下列物質(zhì)溶液的磷-35標(biāo)記的PKS-5DNA相混雜，時(shí)間16小時(shí)，溫度42℃，所述溶液有下列組成：0.9MNaCl150mM磷酸鈉（PH7.0），5mMEDTA，0.1%SDS，4×Denhardts、0.4mg/mltRNA，0.25mg/ml小牛胸腺DNA和50%甲酰胺。用0.1%SDS和0.25×SSC組成的溶液，在溫度60℃將過濾器洗滌4次，時(shí)間30分鐘，洗畢，利用LighteningPlus強(qiáng)化篩網(wǎng)使過濾器暴露到Cronex4x-射線軟片。圖17表明，在重組體AcNPV感染的細(xì)胞中檢出一個(gè)2.2千堿對(duì)的寬帶，而上野生型感染細(xì)胞中則未發(fā)現(xiàn)。

7.4.2利用免疫沉淀法鑒定用重組體桿狀病毒感染的細(xì)胞表達(dá)的與LAV/HTLVⅢgag相關(guān)的蛋白質(zhì)。

以下描述的免疫沉淀測(cè)定法證明，用本發(fā)明的重組體桿狀病毒感染的細(xì)胞能合成與愛滋病病人血清發(fā)生特異免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)。

將Sf9細(xì)胞接種到60毫米培養(yǎng)皿上（每個(gè)培養(yǎng)皿有5×106只細(xì)胞，并用Ac-gag1中的野生型AcNPV感染。在感染后24、48和72小時(shí)，原先培養(yǎng)基用無蛋氨酸的培養(yǎng)其更換，細(xì)胞上28℃下培養(yǎng)30分鐘。在這以后培養(yǎng)基用含有100微克/毫升[35S]蛋氨酸的無蛋氨酸培養(yǎng)基更換，標(biāo)記過程在28℃下需進(jìn)行2小時(shí)。

在標(biāo)記結(jié)束后，細(xì)胞用含有0.01MTris-Hcl（PH7.2）和0.15MNaCl的溶液洗滌兩次，然后離心分離法收集。每只60毫米培養(yǎng)皿中取出的細(xì)胞丸再懸浮在1毫升溶解緩沖液中，所述溶解緩沖溶液組成如下：1%NP-40（聚氧乙烯（9）P-tart-辛基酚），0.5脫氧膽酸鈉，0.1MNaCl，0.01MTris-HCl（PH7.4）和1mMEDTA，細(xì)胞溶解產(chǎn)物在100，000Xy條件下離心分離30分鐘，以進(jìn)行澄清。

將取自對(duì)照人群或愛滋病人的熱滅活的人體血清4微升，加到500毫升細(xì)胞溶解產(chǎn)物中，以進(jìn)行免疫沉淀。在4℃下培養(yǎng)半小時(shí)后，加入80微升活化的Staphylococcusaureus細(xì)胞（Pansorbincell，Calbiochem-BehringCorp.，LaJolla，CA），在4℃下繼續(xù)培養(yǎng)半小時(shí)。免疫沉淀復(fù)合物是在4℃下在SorvallA384轉(zhuǎn)子中以轉(zhuǎn)速為5000轉(zhuǎn)/分離心分離5分鐘加以收集，然后用含有1MNaCl，0.1%NP-40和0.01MTris-Hcl，PH為7的溶液洗滌一次，接著再用RIRA緩沖液（10mMTris-HCl，PH7.2，0.15MNaCl，1%脫氧膽酸鈉，1%月桂基硫酸鈉，1%TritonX-100）洗滌三次。將經(jīng)洗滌的免疫沉淀物再次懸浮在80微升的Laemmli樣品緩沖液中，加熱沸騰1分鐘后在SorvallA384轉(zhuǎn)子中以轉(zhuǎn)速為5000轉(zhuǎn)/分離心分離5分鐘。存在于上層清液內(nèi)的免疫沉淀的蛋白質(zhì)在10%SDS聚丙稀酰胺凝膠中用電脈法進(jìn)行分析。電脈后，凝膠用Coomassie藍(lán)色染料著色，繼而用水揚(yáng)酸鈉處理（30分鐘，室溫，1M水揚(yáng)酸鈉），干燥后進(jìn)行熒光照相。

有人提出，成熟的gag蛋白質(zhì)（24，000道爾頓，P-24;16，000道爾頓，P16;1400道爾頓，P-14）可從一種較大的55000道爾頓前體蛋白質(zhì)中處理得到。圖14表示分子量為67，000，55，000，40，000，34，000，32，000和24，000道爾頓的蛋白質(zhì)能有效地被愛滋病人的血清免疫沉淀。

為了驗(yàn)證圖18中描述的任何有免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)之間是否存在前體/產(chǎn)物關(guān)系，特進(jìn)行了脈沖-跟蹤實(shí)驗(yàn)。Sf9細(xì)胞按照上面描述的方法進(jìn)行感染。感染后24小時(shí)，細(xì)菌用[35S]蛋氨酸標(biāo)記5分鐘;接著用完全培養(yǎng)基洗滌。并在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)2、4和8小時(shí)。在這些時(shí)間內(nèi)，收集三個(gè)不同時(shí)間的細(xì)胞，然后進(jìn)行免疫沉淀。免疫沉淀的蛋白質(zhì)，在如上所述的10%SDS聚丙烯酰胺凝膠中分級(jí)。圖19表示該實(shí)驗(yàn)的一個(gè)熒光照相片。數(shù)據(jù)表明，P67，P55，P40，P34和P32在5分鐘后結(jié)合標(biāo)記。在8小時(shí)追蹤后，在P67和P55中，標(biāo)記減少，而上P34中標(biāo)記增加。在P40的放射性標(biāo)記量保持相對(duì)恒定。

7.4.3用ELISA鑒別與LAV/HTLVⅢgag相關(guān)的蛋白質(zhì)

十只100毫升培養(yǎng)皿，每只盛有107Sf9細(xì)胞，用Ac-gag1感染。在感染后24小時(shí)，收集細(xì)胞，用含用0.01MTris-HCl（PH7.2）和0.15MNaCl的溶液洗滌兩次，然后冷凍-融化三次。接著在冰浴中用2毫升含有0.5%NP-40的PBS的溶液破壞細(xì)胞5分鐘。將細(xì)胞溶解產(chǎn)物在1000×g條件下離心分離10分鐘，移去上層清液。加入4毫升碳酸鹽緩沖液（50mM碳酸鈉，PH9.6）混合物在Eppenderf離心機(jī)中旋轉(zhuǎn)20分鐘。移去上層清液，如表Ⅲ所示用碳酸鹽緩沖液稀釋。這些細(xì)胞溶解產(chǎn)物被用于涂在96井微滴培養(yǎng)皿上，放置過夜，溫度4℃（50微升/井）。第二天在每只井中加入300微滴保護(hù)性（封閉）試劑（5%無脂奶粉，0.01%乙基汞硫代水揚(yáng)酸鈉，0.01%抗泡沫劑A的10×PBS溶液），室溫下培養(yǎng)45分鐘。取出封閉試劑，再在每只井中加入用封閉試劑稀釋100倍的50微升人體血清。加入前，稀釋的血清（愛滋病病人血清或正常人血清）先在37℃溫度下培養(yǎng)45分鐘。

使每只井在37℃下反應(yīng)1小時(shí)，然后用含有氯化鈉和吐溫-20（聚氧乙烯，甘油-月桂酸脫水山犁醇脂）洗滌三次。每只井內(nèi)加入100微升山羊抗人體辣根過氧化物酶共軛物（用含有0.01%乙基汞硫代水揚(yáng)酸鈉的正常山羊血清稀釋1000倍），并使之在37℃反應(yīng)1小時(shí)。培養(yǎng)皿經(jīng)洗滌后，每只井內(nèi)再加入100微升緩沖基質(zhì)和色原試劑的溶液，其中緩沖基質(zhì)為過氧化氫、檸檬酸、磷酸鹽緩沖劑;色原試劑為在二甲基亞砜中的四甲基聯(lián)苯胺。培養(yǎng)皿在室溫下培養(yǎng)30分鐘。接著每只井中加入100微升的3N硫酸，使反應(yīng)終止。在450nm處測(cè)定反應(yīng)混合物的光吸收率，參考吸收率為630nm。所得結(jié)果示于表Ⅷ，其中TR1、Y-1、CF22C和CF9是愛滋病人血清，而2、16、21和48是正常人體血清。

總之，圖17-19和表8所示結(jié)果表明，所述的重組體桿狀病毒能夠：（a）表達(dá)插入的LAV/HTLVⅢgag基因，（b）改進(jìn)或處理這種基因產(chǎn)物，（c）產(chǎn)生與愛滋病人血清發(fā)生特異免疫反應(yīng)的抗原蛋白質(zhì)。

表8

ELISA測(cè)定的吸收率數(shù)值A(chǔ)c-gag1細(xì)胞溶解物稀釋度

試驗(yàn)

抗血清50-1100-1200-1400-1800-11000-1

愛滋病

TR12.6192.4712.2352.0761.7861.499

2.5042.4792.2162.1191.8771.500

Y-12.5022.3542.0461.5641.2981.014

2.3052.3062.0061.5951.2821.078

CF22C2.4862.3171.9241.3931.0090.811

2.3192.2411.8381.3311.0680.848

CF92.3032.1101.3390.8550.6360.512

2.2092.0121.3050.8500.6590.455

正常人：

20.2210.2040.3120.1990.2280.222

0.2290.1870.1760.2270.2080.210

160.1760.1750.2170.1310.1440.129

0.1650.1350.1390.2100.1750.145

210.1930.1900.2160.1890.2370.165

0.2050.1760.1700.1990.1970.224

480.2000.1850.2170.1770.1900.134

0.2490.1690.1630.1750.1730.143

8、實(shí)施例：牛痘gag基因重組體

在以下的實(shí)施例中，構(gòu)成的質(zhì)粒載體含有包括位于牛痘病毒的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)的下方的LAV/HTLVⅢgag基因編碼順序的嵌合基因。含有牛痘病毒7.5k啟動(dòng)區(qū)和LAV/HTLVⅢgag基因順序的嵌合基因經(jīng)體內(nèi)重組被插入到牛痘病毒的基因中。將這種重組的病毒進(jìn)行鑒別和提純并且由受感染的組織培養(yǎng)細(xì)胞制備病毒原種。在體外試驗(yàn)中可顯示出重組牛痘病毒所產(chǎn)生具有免疫反應(yīng)的LAV/HTLVⅢgag基因的有關(guān)蛋白質(zhì)。以下的章節(jié)將詳細(xì)地?cái)⑹霰景l(fā)明的這一實(shí)施例的每個(gè)步驟。本實(shí)施例中所采用的一般工藝如6.1節(jié)中所述。

8.1含有一種聯(lián)結(jié)在LAV/HTLVⅢgag基因的編碼順序上的牛痘病毒啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體的構(gòu)成。

含有聯(lián)結(jié)在具有g(shù)ag編碼順序的LAV/HTLVⅢ基因組的不同長度上的牛痘病毒7.5k啟動(dòng)區(qū)的五種質(zhì)粒載體得到構(gòu)成。LAV/HTLVⅢgag編碼順序源是λJ19（Wain-Hobson等人、Cell40∶1985）的兩種有關(guān)的亞克隆PKS-5和PSS-5。質(zhì)粒PKS-5含有-3148堿基對(duì)，即在PUC18的相應(yīng)位置上插入的LAV/HTLVⅢDNA的SstⅠ對(duì)KPnⅠ（核苷酸編號(hào)224對(duì)3372）的碎片。質(zhì)粒PSS-5含有-5107堿基對(duì)，即在PUC18的相應(yīng)位置上插入的LAV/HTLVⅢDNA的SstⅠ對(duì)SalⅠ（核苷酸編號(hào)224對(duì)5221）的碎片。以PKS-5或者PSS-5衍生的gag編碼順序的不同長度插入到質(zhì)粒PGS62中，除了具有一個(gè)位于單-SmaⅠ位下方的單-EcoRⅠ位之外（參見圖20），它與PGS20相同（Mackett等人、，1984，J·Virol，49∶857-864）。被插入到PGS62中的LAV/HTLVⅢ的種順序均始于位于gag基因的始密碼子的上方的76堿基對(duì)的ThaⅠ（FnuDⅡ）位（核苷酸257）。質(zhì)粒PV-gag1、PV-gag2、PV-gag3、PV-gag4以及PV-gag5含有從ThaⅠ位分別經(jīng)EcoRⅠ（為4194）、KpnⅠ（為3372）、EcoRⅤ（為2523）、BclⅠ（為1975）或者BglⅡ（為1642）位的LAV/HTLVⅢ種順序。參照?qǐng)D20對(duì)每種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)作以下敘述會(huì)更為方便。

PV-gag1的構(gòu)成：由限制性內(nèi)切酶ThaⅠ和EcoRⅠ完全消化5微克質(zhì)粒Pss-5DNA。在1%LMP瓊酯糖凝膠上分離所得的碎片。分離出含有LAV/HTLVⅢgag編碼順序的3.9Kbp碎片并被聯(lián)結(jié)到上述用SmaⅠ和EcoRⅠ消化的PGS62上。聯(lián)結(jié)混合物用以使大腸桿菌HB101（E·ColiHB101）轉(zhuǎn)化和選擇抗氨芐青霉素克隆。通過限制分析對(duì)個(gè)體克隆的質(zhì)粒中3.9Kbp插入物的存在及EcoRⅠ接合位上再生的情況進(jìn)行測(cè)定。所得的構(gòu)成體含有g(shù)ag和蛋白酶（Prt）基因的完整的編碼順序以及大部分Pol基因的開放讀碼，直到核苷酸4194的EcoRⅠ位。

PV-gag2的構(gòu)成：由限制性內(nèi)切酶將ThaⅠ和SmaⅠ完全消化5微克質(zhì)粒PKS-5。PKS-5的SmaⅠ位系鄰近KpnⅠ位，該位置是在LAV/HTLVⅢ衍生且插入的順序和PUC18質(zhì)粒多克隆位之間接合。在1%LMP瓊脂糖凝膠上分離所得的碎片。分離得到含有LAV/HTLVⅢgag順序的3.2Kbp的碎片并且被聯(lián)結(jié)到上述用SmaⅠ預(yù)先消化和用CIAP處理的PGS62DNA上。聯(lián)結(jié)混合物用以使E·CoilHB101轉(zhuǎn)化和選擇抗氨芐青霉素的克隆。試驗(yàn)由對(duì)個(gè)體克隆得到的質(zhì)粒是否存在3.1Kpb碎片進(jìn)行測(cè)定，并由限制性分析確定插入物的定位。PV-gag2所得的構(gòu)成體含有完整的gag基因、Prt基因以及一部分Pol基因的開放讀碼，直到核苷酸3372的KpnⅠ位。

PV-gag3的構(gòu)成：除了由ThaⅠ產(chǎn)生2.3Kbp碎片和用于在SmaⅠ位插入至PGS62的PKS-5的EcoRⅤ聯(lián)結(jié)之外，與PV-gag2相似。PV-gag3的最終結(jié)構(gòu)含有完整的gag和Prt基因以及一小部分并合到3′部分的牛痘病毒TK基因的Pol基因。

PV-gag4的構(gòu)成：由SstⅠ和BclⅠ完全消化5微克質(zhì)粒PSS-5DNA。提純含有LAV/HTLVⅢgag順序的所得的碎片。使這種碎片聯(lián)結(jié)到上述事先用SstⅠ和BamHⅠ切割的質(zhì)粒載體PIC19R（Marsh等人·，1984，Gene32∶481-485）上構(gòu)成一中間體質(zhì)粒。gag順序插入到PIC19R的BamHⅠ位中導(dǎo)致LAV/HTLVⅢ順序中的BclⅠ位并置在克隆載體的這種多位中的EcoRⅠ位。由限制性內(nèi)切酶ThaⅠ和EcoRⅠ消化這種中間構(gòu)成而產(chǎn)生1.72Kbp可易于在SmaⅠ和EcoRⅠ位插入到質(zhì)粒PGS62中的碎片。PV-gag4的最終構(gòu)成物含有完整的LAV/HTLVⅢgag基因和一部分并合到3′部分的牛痘病毒TK基因上的Prt基因。

質(zhì)粒PV-gag5的構(gòu)成系利用與PV-gag4相同的兩步策略。用限制性內(nèi)切酶SstⅠ和BglⅡ消化5微克PSS-5。分離含有LAV/HTLVⅢgag順序的1.42Kbp碎片，并在1%LMP瓊脂糖凝膠上分離提純，在SstⅠ和BglⅡ位上插入質(zhì)粒PIC19R。將在BglⅡ位上的gag順序聯(lián)結(jié)到其PIC19R上的相應(yīng)位置上使（a）在具有g(shù)ag開放讀碼的相中產(chǎn)生一終止密碼子和（b）斜接于BglⅡ位并置于多克隆位質(zhì)粒上的鄰接的EcoRⅠ位。然后，用ThaⅠ和EcoRⅠ消化這種中間構(gòu)成體。提純含有LAV/HTLVⅢgag順序的1.39Kbp碎片并在SmaⅠ和EcoRⅠ位上聯(lián)結(jié)在質(zhì)粒PGS62上。最終形成質(zhì)粒PV-gag5，含有大多數(shù)而不是所有的結(jié)扎在一碼中翻譯終止順序上的gag（直到BglⅡ位）的編碼順序。

8.2含有嵌合LAV/HTLVⅢgag基因的重組牛痘病毒的構(gòu)成

按適用于V-env5和V-env2的構(gòu)成（參見6.3節(jié)）的相同報(bào)告達(dá)到嵌合LAV/HTLVⅢgag基因自質(zhì)粒載體PV-gag1、PV-gag2、PV-gag3、PV-gag4及PV-gag5中插入到牛痘病毒基因組中。在以下的一些實(shí)施例中，所有的重組病毒均由噬菌斑凈化的NewYorkCityBoardofHealth菌種（V-NY，參見6.1.1節(jié)）構(gòu)成。選擇TK-重組體并在發(fā)展成為適用于以后的鑒定的病毒原種之前以噬菌斑凈化三次。將自PV-gag1、PV-gag2、PV-gag3、PV-gag4及PV-gag5中衍生的重組病毒分別稱之V-gag1NY、V-gag2NY、V-gag3NY、V-gag4NY及V-gag5NY。

8.3在經(jīng)重組體牛痘病毒感染的組織培養(yǎng)細(xì)胞中

LAV/HTLVⅢgag有關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)

帶有上述的嵌合LAV/HTLVⅢgag基因的重組體牛痘病毒能夠表達(dá)組織培養(yǎng)中細(xì)胞感染時(shí)LAV/HTLVⅢgag的有關(guān)蛋白質(zhì)。這些重組體中的一些重組體能夠使前體gag蛋白質(zhì)P55加工成成熟的蛋白質(zhì)P25和P18。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，這些蛋白質(zhì)是能與AIDS病人血清和（或）以防gag蛋白質(zhì)P25或P18的單克隆抗體呈免疫反應(yīng)。

在10moi下，由親本類型牛痘病毒（V-NY）或者用其重組衍生物：V-gag1NY、V-gag2NY、V-gag3NY、V-gag4NY或V-gag5NY在60毫米培養(yǎng)皿中使所含的BSC-40細(xì)胞受到感染。感染進(jìn)行12小時(shí)，然后收獲細(xì)胞，用PBS洗滌一次，再離心收集。使受感染的細(xì)胞片狀沉淀物在0.3毫升Laemmli試樣緩沖液中再懸浮并沸騰4分鐘使其溶解。在取20微升細(xì)胞溶解液在15%SDS聚丙烯酰銨凝膠電泳，以分離整個(gè)蛋白組份。作為控制品要包括凈化的LAV/HTLVⅢ病毒粒子及作為模型的被感染細(xì)胞溶解液的等分試樣。

使凝膠中的含有物電轉(zhuǎn)移到硝化纖維過濾片的紙上。首先使過濾片與AIDS病人血清反應(yīng)或者與以防gag蛋白質(zhì)P25和P18的單克隆抗體的組合物反應(yīng)。在徹底洗滌之后，再使過濾片與堿性磷酸酶（AP-共軛）共軛的山羊抗人體的免疫球蛋白抗體反應(yīng)（當(dāng)使用病人血清時(shí)）或者與AP共軛的山羊抗鼠免疫球蛋白抗體反應(yīng)，（當(dāng)使用鼠的單克隆抗體時(shí)）。第一、二種抗體反應(yīng)條件以及洗滌條件如6.4.1節(jié)中所述。第二次抗體反應(yīng)之后，用加有0.1MNaCl和5mMgCl2的0.1MTris（PH9.5）作最后洗滌。由使過濾片與含有0.1MTris（PH9.5緩沖液）、0.1MNaCl、5mMMgCl2以一個(gè)含有0.1MTris（PH9.5緩沖液）0.1MNaCl，5mMMgCl2，0.33mg/ml磷酸溴氯吲哚（bromo-chloroindolglphosphate）以及0.17mg/ml氮蘭四唑的溶液反應(yīng)檢測(cè)過濾片上結(jié)合成抗原的抗體。使過濾器與色素源反應(yīng)之后，在水中漂清，空干和照相。

圖21所示為這分析結(jié)果。V-gag1NY和V-gag2NY重組體含有完整的gag和prt基因。這些重組體表達(dá)與LAV/HTLVⅢ的主要gag蛋白質(zhì)P55、P40、P25及P18共同遷移的有關(guān)蛋白質(zhì)的LAV/HTLVⅢ的一個(gè)家族。這些蛋白質(zhì)是與AIDS病人血清（圖21B）和抗P25和P18的鼠單克隆抗體（圖21A）免疫反應(yīng)的產(chǎn)物。V-gag3NY在組體含有g(shù)ag和prt基因，但是其Pol開放讀碼被聯(lián)結(jié)在具有牛痘TK基因的羧基未端部分的相中。V-gag3NY還能夠表達(dá)最初的gag基因產(chǎn)物P55。然而，P55的處理效率似乎比V-gag1NY和V-gag2NY的低，因?yàn)橛肰-gag3NY感染的細(xì)胞溶解液中P55比P25和P18少得多。重組體V-gag4NY含有完整的gag基因，但是只有部分prt基因。它合成了一種尺寸與P55相似，LAV/HTLVⅢ的有關(guān)的蛋白質(zhì)。重組體V-gag5NY含有僅部分gag基因，表達(dá)一種43KD的截短的蛋白質(zhì)（圖21c）。雖然，V-gag4NY和V-gag5NY似乎卻不能有效地處理它們有關(guān)蛋白質(zhì)的最初gag，它們是對(duì)抗P25和P18的單克隆抗體的免疫反應(yīng)的產(chǎn)物?？傊M管它們處理能力不同，但五種重組體卻都能表達(dá)具有免疫反應(yīng)性的蛋白質(zhì)，它系含有LAV/HTLVⅢ核心蛋白質(zhì)的主要表位。

9、實(shí)施例：桿狀病毒外殼重組體

在以下的實(shí)施中，構(gòu)成的質(zhì)粒載體含有包括位于ACNPV的轉(zhuǎn)錄控制順序下游的LAV/HTLVⅢenv編碼順序的嵌合基因。把含有AeNpV多面體啟動(dòng)區(qū)和LAV/HTLVⅢenv編碼順序的嵌合基因經(jīng)在體內(nèi)重組合插入到ACNPV的基因組中。鑒定和提純重組病毒，由受感染的細(xì)胞的上清液制備病毒原種。業(yè)已表明，在體外試驗(yàn)中重組桿狀病毒可產(chǎn)生具有免疫反應(yīng)LAV/HTLVⅢenv的有關(guān)蛋白質(zhì)。以下小節(jié)中將詳細(xì)地?cái)⑹霰景l(fā)明的這一實(shí)施例的每一個(gè)步驟。本實(shí)施例中所采用的一般工藝如7.1節(jié)中所述。

9.1含有聯(lián)結(jié)在LAV/HTLVⅢenv基因的編碼順序上的AcNPV啟動(dòng)區(qū)的質(zhì)粒載體的構(gòu)成

從PV-env5中提純LAV/HTLVⅢenv編碼順序，它用于構(gòu)成業(yè)已以有關(guān)蛋白質(zhì)的env基因表示的重組牛痘病毒V-env5。BamHT位兩端位于最接近的與96堿基對(duì)5′位和223堿基對(duì)3′位接近未翻譯的順序在一起的PV-env5中的env編碼區(qū)的側(cè)面。這種質(zhì)粒（它也含有一內(nèi)部BamHT部位）經(jīng)用限制性內(nèi)切酶BamHT的部分消化產(chǎn)生僅含有LAV/HTLVⅢ的特定順序的2.9Kbp碎片。使這種碎片（大約0.5微克）用1%LMP瓊酯糖凝膠分離和提純并被聯(lián)結(jié)在0.5微克質(zhì)粒載體PAC610上，PAC610系事先用BamHT線性化和用CIAP處理。聯(lián)結(jié)的混合物可用以使E·coli菌株Mc1000轉(zhuǎn)變并選擇抗氨芐青霉素的菌落。在有LAV/HTLVⅢenv順序存在（亦即.用BamHT消化產(chǎn)生2.3Kbp和0.54Kbp碎片）的情況下試驗(yàn)由單個(gè)轉(zhuǎn)變體組成的質(zhì)粒DNA對(duì)以及對(duì)插入物的定位用LAV/HTLVⅢenv順序在正確位置中插入的質(zhì)粒經(jīng)純化并以PAC-env5表示。其結(jié)構(gòu)示于圖22。

9.2含有嵌合LAV/HTLVⅢenv基因的桿狀病毒重組體的構(gòu)成

如7.3節(jié)所述，通過體內(nèi)重組作用達(dá)到把嵌合的AV/HTLVⅢenv基因插入到AVNPV基因組中。再如同一節(jié)所述，使ACNPVDNA（1mg）、PAC-env5DNA（5mg）及牛犢胸腺DNA（15mg）轉(zhuǎn)染到sf9細(xì)胞中。在用4毫升完全培養(yǎng)基于28℃下培育5天之后，收集上清液并在1000×g下離心澄清10分鐘。在Sf9細(xì)胞上滴定病毒原種，并且首先用以下所述的M、D、Summers和G、E、Smith的噬菌斑雜交化測(cè)定法鑒定重組病毒：

將Sf9細(xì)胞接種在60×15毫米的培養(yǎng)平板上，在無血清的TNM-FH培養(yǎng)基中，每塊平板上的細(xì)胞密度為2.5×10。細(xì)胞附著之后，去除培養(yǎng)基，在每地平板上加入一毫升稀釋的病毒接種物。在27℃下培育1小時(shí)后，去除每塊平板上的所有接種物菌，把4毫升LMP瓊脂覆層慢慢地加在每塊平板的邊緣上。覆層凝固之后，平板在濕的環(huán)境中培養(yǎng)4-6天，或者一直到良好地形成噬菌斑。然后使平板干燥過夜或更長此時(shí)間使板放置在不濕的環(huán)境中。在達(dá)到足夠的干燥時(shí)，去除瓊脂覆層，把干燥的硝化纖維素沾片放在平板中所保持的細(xì)胞的頂部。用溶液A（0.005MTris-Hcl，PH7.4，0.15MNacl）使Whatman3MM的47毫米濕紙飽和并放在硝基纖維素濾片之上，俟?jié)B開后，將硝化纖維素濾片小心地移開，并把它放在以溶液B（0.5NNaoH，1.5MNacl）飽和的Whatman過濾紙上。2-3分鐘后，用紙巾上將硝化纖維過濾紙空氣中吸干然后轉(zhuǎn)移到用溶液C（1.0MTris-Hcl，PH7.4，1.5MNacl）飽和的Whatman過濾紙上。2-3分鐘后，在紙巾上使硝化纖維過濾紙?jiān)诳諝庀赂?，再慢慢地浸入業(yè)裝滿溶液D（0.3MNacl，0.03M擰檬酸鈉）的陪替氏培養(yǎng)皿中洗滌。爾后，取出在紙巾上干燥，再在真空中80℃下烘2小時(shí)。使濾片與32P標(biāo)記PRS-3雜交作為探測(cè)劑。挑取重組病毒并再滴定在Sf9細(xì)胞上。用肉眼鑒別未密封的噬菌斑。這些經(jīng)三次以上提純噬菌斑用于制備以下研究中用的病毒原種。

9.3在由重組桿狀病毒Ac-envs感染的組織培養(yǎng)細(xì)胞中有關(guān)蛋白質(zhì)的LAV/HTLVⅢenv的表示

業(yè)已表明，帶嵌合的LAV/HTLVⅢenv基因的重組ACNPV是能夠在細(xì)胞在組織培養(yǎng)中感染時(shí)表示LAV/HTLVⅢenv的有關(guān)蛋白質(zhì)。并且指出，這些蛋白質(zhì)是與AIDS病人血清以及與限定LAV/HTLVⅢ包膜糖蛋白gp110和gp41的單克隆抗體能呈免疫反應(yīng)。

用野生型ACNPV或者其重組AC-env5在5moi下使在100毫米培養(yǎng)皿上接種的Sf9細(xì)胞（1×10）感染。在感染28小時(shí)以后，在沒有血清補(bǔ)給的情況下，介質(zhì)由無蛋氨酸的培養(yǎng)基取代并培養(yǎng)30分鐘。完畢后，用含有100uci/ml[35S]蛋氨酸的2毫升無蛋氨酸培養(yǎng)基取代該培養(yǎng)基，使能在28℃下標(biāo)記化2小時(shí)。標(biāo)記期結(jié)束，用PBS洗滌細(xì)胞兩次，然后如6、4、2節(jié)中所述，在1毫升溶解緩沖液中再懸浮。如6、4、2節(jié)中所述，用AIDS病人血清也可同樣用gp110或gp41的鼠的單克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀。

這種分析結(jié)果指出似圖23所表示的重組病毒Ac-env5主要合成了一種LAV/HTLVⅢ外殼的有關(guān)150KD的蛋白質(zhì)。因?yàn)榕c由牛痘重組V-env5合成的gp150共同遷移和與AIDS病人血清以及抗gp110和gp41的單克隆抗體的免疫反應(yīng)，所以這種蛋白質(zhì)代表糖基化前體外殼蛋白質(zhì)gp150。這種分子處理是不充分的，因?yàn)樵趦尚r(shí)標(biāo)記期內(nèi)檢測(cè)不出gp110或gp41。然而，因?yàn)間p110和gp41的兩者大多數(shù)表位均處于前體上，所以這種蛋白質(zhì)作為診斷劑和作為免疫源是具有潛在的價(jià)值的。

10、微生物的存放

攜帶所列質(zhì)粒的以下大腸桿菌（E·coli）菌株業(yè)已存放在美國、伊利諾斯州（IL）、皮奧里亞（Peorial）的農(nóng)業(yè)研究培養(yǎng)收集部（NRRL），存取編號(hào)如下：

E.Coli菌株質(zhì)粒存取編號(hào)

K12MC1000PV-env1NRRLB-18003

K12MC1000PV-emv2NRRLB-18004

K12MC1000PV-env5NRRLB-18005

K12MC1000PV-env7NRRLB-18110

K12HB101PV-gag1NRRLB-18111

K12HB101PAC-gag1NRRLB-18105

K12NF1829PACenv5NRRLB-18109

以下重組病毒業(yè)已存放在美國馬里蘭州（MD）、羅克1維爾（Rockville）的美國典型培養(yǎng)收集，存取編號(hào)如下：

重組病毒存取編號(hào)

V-env2ATCCVR2114

V-env5ATCCVR2113

V-env7ATCCVR2148

V-env5NYATCCVR2149

V-gag1NYATCTVR2150

AC-gag1ATCTVR2147

AC-env5ATCTVR2151

本發(fā)明并不限于微生物和所存放的病毒的范圍，因?yàn)榇娣艑?shí)例僅作為本發(fā)明的一個(gè)方面的個(gè)別說明，功能上相當(dāng)?shù)娜魏挝⑸锘蛘卟《揪诒景l(fā)明的范圍之內(nèi)。確實(shí)，除了本文說明和敘述的這些之外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上述的說明和附圖顯然可以對(duì)本發(fā)明作出各種的改進(jìn)。這種改進(jìn)仍在以下權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。

還應(yīng)指出，核苷酸所有堿基對(duì)的尺寸是近似的，用于說明的目的。