背景技術(shù)：

1、用于bia(包括嗎啡喃生物堿及其衍生物)的現(xiàn)有制造方法存在產(chǎn)率低和/或昂貴的問(wèn)題。一些用于制造bia的已知方法存在不期望量的嗎啡喃生物堿副產(chǎn)物的產(chǎn)生(參見例如，rinner,u.和hudlicky,j.,2012,top.cur.chem.209:33-66)。不存在商業(yè)生物合成制造bia(包括嗎啡喃生物堿及其衍生物)的方法。因此，需要用于合成bia(包括嗎啡喃生物堿及其衍生物)的改善的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本公開文本提供了用于在工程化宿主細(xì)胞中產(chǎn)生多種芐基異喹啉生物堿(bia)的方法。在某些實(shí)施方案中，所述工程化宿主細(xì)胞為非植物細(xì)胞。本公開文本進(jìn)一步提供了在工程化宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的多種生物堿的組合物。另外，本公開文本提供了用于在工程化宿主細(xì)胞中表達(dá)一種或多種提供c-14羥化酶活性的酶的方法。在某些實(shí)施方案中，所述一種或多種提供c-14羥化酶活性的酶為細(xì)胞色素p450蛋白(“p450”)。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種提供c-14羥化酶活性的酶對(duì)于所述工程化宿主細(xì)胞來(lái)說(shuō)是異源的。另外，本公開文本提供了用于在工程化宿主細(xì)胞中表達(dá)一種或多種提供c-14羥化酶活性的工程化p450的方法。在特定情況下，本公開文本提供了用于通過(guò)使用提供c-14羥化酶活性的p450來(lái)增加多種生物堿產(chǎn)物的產(chǎn)生的方法。在一些實(shí)施方案中，本公開文本提供了用于通過(guò)甲醛脫氫酶的過(guò)表達(dá)來(lái)增加多種生物堿產(chǎn)物的產(chǎn)生的方法。在一些實(shí)施方案中，本公開文本提供了用于通過(guò)醇脫氫酶的過(guò)表達(dá)來(lái)增加多種生物堿產(chǎn)物的產(chǎn)生的方法。在另外的實(shí)施方案中，本公開文本提供了用于通過(guò)防止谷氨酰胺轉(zhuǎn)酰胺酶的表達(dá)來(lái)增加多種生物堿產(chǎn)物的產(chǎn)生的方法。在一些實(shí)施方案中，本公開文本提供了用于在工程化宿主細(xì)胞中通過(guò)以下方式來(lái)增加多種生物堿產(chǎn)物的產(chǎn)生的方法：經(jīng)由一種或多種提供c-14羥化酶活性的酶將在碳c-14處具有游離氫的前體嗎啡喃生物堿轉(zhuǎn)化為在碳c-14處具有羥基的產(chǎn)物嗎啡喃生物堿。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述在c-14碳處具有氫的前體嗎啡喃生物堿是經(jīng)由異源生物合成途徑在所述工程化細(xì)胞中產(chǎn)生的，所述異源生物合成途徑包含多種酶并且從簡(jiǎn)單的起始材料(諸如糖和/或l-酪氨酸)開始。在一些實(shí)施方案中，本公開文本提供了用于在工程化宿主細(xì)胞中通過(guò)以下方式來(lái)增加多種生物堿產(chǎn)物的產(chǎn)生的方法：經(jīng)由一種或多種提供c-14羥化酶活性的酶將在碳c-14處具有游離氫的前體嗎啡喃生物堿轉(zhuǎn)化為在碳c-14處具有羥基的產(chǎn)物嗎啡喃生物堿。在某些實(shí)施方案中，所述一種或多種提供c-14羥化酶活性的酶對(duì)于所述工程化宿主細(xì)胞來(lái)說(shuō)是異源的。在其他實(shí)施方案中，本公開文本提供了用于通過(guò)經(jīng)由提供c-14羥化酶活性的酶將可待因轉(zhuǎn)化為14-羥基可待因來(lái)增加多種生物堿產(chǎn)物的產(chǎn)生的方法。在另外的實(shí)施方案中，本公開文本提供了用于通過(guò)經(jīng)由提供c-14羥化酶活性的酶將可待因酮轉(zhuǎn)化為14-羥基可待因酮來(lái)增加多種生物堿產(chǎn)物的產(chǎn)生的方法。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本公開文本提供了用于通過(guò)經(jīng)由提供c-14羥化酶活性的酶將可待因轉(zhuǎn)化為14-羥基可待因來(lái)增加多種生物堿產(chǎn)物的產(chǎn)生的方法。在一些情況下，所述方法進(jìn)一步包括使所述宿主細(xì)胞工程化以包含多種異源酶，以從簡(jiǎn)單的起始材料(諸如糖和/或l-酪氨酸)產(chǎn)生多種芐基異喹啉生物堿產(chǎn)物。在一些例子中，工程化宿主細(xì)胞(例如，非植物細(xì)胞)包含多個(gè)編碼序列，所述多個(gè)編碼序列各自編碼選自表17中所列的酶組的酶。在一些例子中，所述異源編碼序列可以可操作地連接。可操作地連接的異源編碼序列可以在經(jīng)由p450(包括一種或多種提供c-14羥化酶活性的酶)產(chǎn)生特定芐基異喹啉生物堿產(chǎn)物的相同途徑內(nèi)。在一些情況下，所述方法進(jìn)一步包括將所述宿主細(xì)胞用多種異源酶工程化以增加bia前體(包括l-酪氨酸和4-hpaa)的產(chǎn)生。在一些例子中，工程化宿主細(xì)胞包含多個(gè)編碼序列，所述多個(gè)編碼序列各自編碼選自表17中所列的酶組的酶。在一些例子中，工程化宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含導(dǎo)致副產(chǎn)物產(chǎn)生減少的所選酶中的失活突變。在一些例子中，工程化宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含導(dǎo)致副產(chǎn)物產(chǎn)生減少的所選酶的異源表達(dá)或過(guò)表達(dá)。在一些例子中，所述副產(chǎn)物包括甲醛、酪醇、苯乙醇或甲硫醇。在一些例子中，工程化宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含導(dǎo)致多種芐基異喹啉生物堿產(chǎn)物的產(chǎn)生增加的所選酶中的失活突變。

2、在一些實(shí)施方案中，本公開文本提供了一種在工程化宿主細(xì)胞中產(chǎn)生芐基異喹啉生物堿(bia)產(chǎn)物的方法，所述方法包括：

3、(a)在所述工程化宿主細(xì)胞中表達(dá)具有14-羥化酶活性的異源酶和(b)任選地在所述工程化宿主細(xì)胞中表達(dá)具有細(xì)胞色素p450還原酶(cpr)活性的異源酶，(c)使所述異源酶與bia前體底物接觸，所述bia前體底物是在碳c-14處具有游離氫的嗎啡喃生物堿，其中所述異源酶使所述bia前體底物上的所述c-14碳羥基化；以及(d)在所述宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生所述bia產(chǎn)物；

4、其中與非工程化宿主細(xì)胞相比，所述工程化宿主細(xì)胞產(chǎn)生更多的bia產(chǎn)物。

5、在一些實(shí)施方案中，所述方法包括在所述宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生(c)中所述的bia前體底物的14-羥基化的產(chǎn)物。

6、在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括(e)通過(guò)一種或多種另外的酶的作用在(d)中所述的分子下游產(chǎn)生另外的bia產(chǎn)物。

7、在一些實(shí)施方案中，與不包含酶a)和/或b)的相同宿主細(xì)胞相比，所述工程化宿主細(xì)胞產(chǎn)生至少1.5倍的所述bia產(chǎn)物。

8、在一些實(shí)施方案中，與不包含酶a)和/或b)的相同工程化宿主細(xì)胞相比，所述工程化宿主細(xì)胞產(chǎn)生多至少50％的所述bia產(chǎn)物。

9、在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括向所述工程化宿主細(xì)胞提供bia前體底物。

10、在一些實(shí)施方案中，所述異源酶為細(xì)胞色素p450。

11、在一些實(shí)施方案中，所述酶能夠?qū)⒖纱蜣D(zhuǎn)化為14-羥基可待因。

12、在一些實(shí)施方案中，所述異源酶包含與seq?id?no.:190、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、178、180、182、184、186、188、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242或244具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

13、在一些實(shí)施方案中，所述異源酶包含seq?id?no:190、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、178、180、182、184、186、188、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242或244的氨基酸序列或由其組成。

14、在一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是不表達(dá)酶a)和/或酶b)的細(xì)胞。

15、在一些實(shí)施方案中，所述bia前體底物選自可待因、可待因酮、去甲可待因酮、氫可酮、去甲蒂巴因、東罌粟堿、嗎啡酮、去甲嗎啡酮、氫嗎啡、去甲氫嗎啡和去甲氫可酮。

16、在一些實(shí)施方案中，所述bia前體底物為可待因酮、可待因、氫可酮或氫嗎啡烷酮(hydromorphone)。

17、在一些實(shí)施方案中，所述bia產(chǎn)物為去甲羥嗎啡烷酮(noroxymorphone)。

18、在一些實(shí)施方案中，所述bia產(chǎn)物為14-羥基可待因。

19、在一些實(shí)施方案中，所述工程化宿主細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞色素p450還原酶(cpr)。

20、在一些實(shí)施方案中，所述cpr對(duì)于所述工程化宿主細(xì)胞來(lái)說(shuō)是異源的。

21、在一些實(shí)施方案中，所述cpr包含與seq?id?no:168、170、172、174、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268或270具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

22、在一些實(shí)施方案中，所述cpr包含seq?id?no:168、170、172、174、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268或270或由其組成。

23、在一些實(shí)施方案中，所述cpr為真菌cpr。

24、在一些實(shí)施方案中，所述cpr為植物cpr。

25、在一些實(shí)施方案中，所述cpr為動(dòng)物cpr。

26、在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞色素p450和所述cpr來(lái)自相同屬。

27、本文還提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生bia產(chǎn)物，所述宿主細(xì)胞包含編碼具有14-羥化酶活性的異源酶的第一異源多核苷酸和編碼細(xì)胞色素p450還原酶(cpr)的第二異源多核苷酸。

28、在一些實(shí)施方案中，具有14-羥化酶的所述酶為細(xì)胞色素p450。

29、在一些實(shí)施方案中，具有14-羥化酶活性的所述酶包含與190、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、178、180、182、184、186、188、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242或244具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

30、在一些實(shí)施方案中，所述cpr為真菌cpr。

31、在一些實(shí)施方案中，所述cpr為植物cpr。

32、在一些實(shí)施方案中，所述cpr為動(dòng)物cpr。

33、在一些實(shí)施方案中，所述cpr包含與seq?id?no.168、170、172、174、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268或270具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

34、在一些實(shí)施方案中，所述bia產(chǎn)物的所述產(chǎn)生包括bia前體底物上的c-14碳的羥基化。

35、在一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞為微生物細(xì)胞、真菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞。

36、在一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞包含含有啟動(dòng)子的核酸構(gòu)建體。

37、本文還提供了一種載體，所述載體包含編碼具有14-羥化酶活性的酶的第一多核苷酸和編碼細(xì)胞色素p450還原酶(cpr)的第二多核苷酸。

38、本文還提供了一種核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含編碼具有14-羥化酶活性的酶的第一多核苷酸和編碼細(xì)胞色素p450還原酶(cpr)的第二多核苷酸。

39、在一些實(shí)施方案中，對(duì)所述第一多核苷酸和/或所述第二多核苷酸進(jìn)行密碼子優(yōu)化以在宿主細(xì)胞中表達(dá)。

40、在一些實(shí)施方案中，具有14-羥化酶的所述酶為細(xì)胞色素p450。

41、在一些實(shí)施方案中，編碼具有14-羥化酶活性的酶的多核苷酸包含選自seq?idno.191、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、179、181、183、185、187、189、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243或245的核苷酸序列。

42、在一些實(shí)施方案中，所述cpr為真菌cpr。

43、在一些實(shí)施方案中，所述cpr為植物cpr。

44、在一些實(shí)施方案中，所述cpr為動(dòng)物cpr。

45、在一些實(shí)施方案中，編碼所述cpr的所述多核苷酸包含選自seq?id?no.169、171、173、175、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269和271的核苷酸序列。

46、在一些實(shí)施方案中，其中具有14-羥化酶活性的所述酶包含與seq?id?no.190、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、178、180、182、184、186、188、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242或244具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

47、在一些實(shí)施方案中，所述cpr包含與seq?id?no.168、170、172、174、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268或270具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

48、本文還提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含載體，所述載體包含編碼具有14-羥化酶活性的酶的第一多核苷酸和編碼細(xì)胞色素p450還原酶(cpr)的第二多核苷酸。

49、在一些實(shí)施方案中，對(duì)所述第一多核苷酸和/或所述第二多核苷酸進(jìn)行密碼子優(yōu)化以在宿主細(xì)胞中表達(dá)。

50、在一些實(shí)施方案中，具有14-羥化酶的所述酶為細(xì)胞色素p450。

51、在一些實(shí)施方案中，編碼具有14-羥化酶活性的酶的多核苷酸包含選自seq?idno.191、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、179、181、183、185、187、189、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243或245的核苷酸序列。

52、在一些實(shí)施方案中，所述cpr為真菌cpr。

53、在一些實(shí)施方案中，所述cpr為植物cpr。

54、在一些實(shí)施方案中，所述cpr為動(dòng)物cpr。

55、在一些實(shí)施方案中，編碼所述cpr的所述多核苷酸包含選自seq?id?no.169、171、173、175、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269和271的核苷酸序列。

56、在一些實(shí)施方案中，其中具有14-羥化酶活性的所述酶包含與seq?id?no.190、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、178、180、182、184、186、188、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242或244具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

57、在一些實(shí)施方案中，所述cpr包含與seq?id?no.168、170、172、174、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268或270具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

58、本文還提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含載體，所述載體包含編碼具有甲醛脫氫酶活性的異源酶的第一異源多核苷酸序列和被設(shè)計(jì)成阻遏靶基因表達(dá)的第二異源多核苷酸，其中所述靶基因選自dug2或dug3。

59、在一些實(shí)施方案中，所述異源酶為sfa1。

60、在一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼具有14-羥化酶活性的酶的第三多核苷酸和編碼細(xì)胞色素p450還原酶(cpr)的第四多核苷酸。

61、本文還提供了一種具有14-羥化酶活性的分離的多肽。

62、本文還提供了一種具有14-羥化酶活性的工程化多肽。

63、本文還提供了一種酶混合物，所述酶混合物包含具有14-羥化酶活性的多肽或工程化多肽以及具有cpr活性的多肽。

64、本文還提供了一種產(chǎn)生芐基異喹啉生物堿(bia)產(chǎn)物的體外方法，所述方法包括使bia前體底物與酶混合物接觸，所述bia前體底物為在碳c-14處具有游離氫的嗎啡喃生物堿，所述酶混合物包含具有14-羥化酶活性的多肽和具有cpr活性的多肽，其中具有14-羥化酶活性的所述異源酶使所述bia前體底物上的所述c-14碳羥基化，從而產(chǎn)生14-羥基化的bia產(chǎn)物。

65、通過(guò)引用并入

66、此說(shuō)明書中提到的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)都通過(guò)引用并入本文，并入程度就像每個(gè)單獨(dú)的出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)被明確和單獨(dú)地指出以通過(guò)引用并入一樣。