本公開總體上涉及微生物宿主細(xì)胞、分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵、蛋白質(zhì)生產(chǎn)等領(lǐng)域。本公開的某些方面涉及新型啟動子和5′-非翻譯區(qū)核酸(dna)序列。相關(guān)申請的交叉引用本技術(shù)要求2022年9月2日提交的美國臨時專利申請?zhí)?3/374,450的優(yōu)先權(quán)，該臨時專利申請的公開內(nèi)容通過援引以其全文并入本文。序列表的引用命名為“nb41861-wo-pct_sequencelisting.xml”的文本文件序列表的電子提交的內(nèi)容創(chuàng)建于2023年8月30日，并且大小為53kb，其特此通過援引以其全文并入。

背景技術(shù)：

1、基因工程促進(jìn)了用作工業(yè)生物反應(yīng)器或細(xì)胞工廠的宿主微生物的各種改進(jìn)。例如，革蘭氏陽性細(xì)菌宿主細(xì)胞可以生產(chǎn)并分泌大量有用的蛋白質(zhì)和代謝物。工業(yè)中使用的最常見芽孢桿菌屬物種(bacillus?sp.)是地衣芽孢桿菌(b.licheniformis)、解淀粉芽孢桿菌(b.amyloliquefaciens)和枯草芽孢桿菌(b.subtilis)。由于其通常認(rèn)為安全(gras)的狀態(tài)，芽孢桿菌屬物種的菌株是用于生產(chǎn)用于食品和制藥工業(yè)中的蛋白質(zhì)的天然候選物。例如，重要的生產(chǎn)酶包括α-淀粉酶、中性蛋白酶、堿性(或絲氨酸)蛋白酶等。然而，盡管對芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中生產(chǎn)蛋白質(zhì)的認(rèn)識有所進(jìn)步，仍然需要通過微生物改善這些蛋白質(zhì)的表達(dá)/生產(chǎn)的方法及其組合物。

2、由目的基因(或orf)編碼的目的蛋白(poi)的重組生產(chǎn)典型地通過構(gòu)建適用于所需宿主細(xì)胞的表達(dá)載體來完成，其中編碼所需poi的核酸置于啟動子的表達(dá)控制之下。因此，通過各種技術(shù)(例如，經(jīng)由轉(zhuǎn)化)將表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞，并通過在適于表達(dá)和生產(chǎn)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)所需蛋白質(zhì)產(chǎn)物的生產(chǎn)。例如，已經(jīng)描述了用于重組表達(dá)功能性多肽的芽孢桿菌屬物種啟動子(及其相關(guān)元件)(例如，kim等人,2008和美國專利號4,559,300)。盡管已知許多啟動子，但本領(lǐng)域仍然需要可以改善編碼目的蛋白的異源核酸的表達(dá)的新型啟動子(核酸)序列。例如，在工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域中，甚至工業(yè)相關(guān)蛋白(例如，酶、抗體、受體等)的表達(dá)/生產(chǎn)水平的相對小幅增加也轉(zhuǎn)化為所生產(chǎn)的重組蛋白的顯著成本、能量和時間節(jié)省。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、如本文總體所述，本公開尤其提供了用于在革蘭氏陽性細(xì)菌(宿主)細(xì)胞中生產(chǎn)目的蛋白的組合物和方法。某些實(shí)施例涉及新型啟動子和5′-utr核酸(dna)序列，包含新型啟動子/5′-utr序列的重組多核苷酸(例如，載體、質(zhì)粒、表達(dá)盒等)，包含可操作地連接到編碼蛋白質(zhì)信號(分泌)序列的dna序列、和/或可操作地連接到編碼前區(qū)序列的dna序列、可操作地連接到編碼目的蛋白的dna序列等的新型啟動子/5′-utr序列的重組多核苷酸。

2、因此，本公開的某些實(shí)施例提供了包含在seq?id?no:8至seq?id?no:46中的任一個中所示的至少一個突變的變體核酸序列，其中這些變體核酸序列的核苷酸位置根據(jù)seqid?no:1編號。在某些其他實(shí)施例中，變體核酸包含seq?id?no:8至seq?id?no:46中的任一個的核苷酸序列，其中這些變體序列的核苷酸位置根據(jù)seq?id?no:1編號。在某些其他實(shí)施例中，變體核酸序列與seq?id?no:1具有至少約97.5％同一性。在相關(guān)方面，本公開的變體核酸序列可以被稱為變體啟動子/5′-非翻譯區(qū)(5-utr)序列。

3、某些其他一個或多個實(shí)施例涉及包含本公開的變體核酸序列的多核苷酸(dna)。因此，某些實(shí)施例提供了包含本公開的變體核酸序列的多核苷酸，這些變體核酸序列可操作地連接到編碼目的蛋白的下游(3′)核酸序列。

4、在某些其他實(shí)施例或方面，包含本公開的變體核酸序列的多核苷酸可操作地連接到編碼前區(qū)序列的下游(3′)核酸序列，該下游(3′)核酸序列可操作地連接到編碼成熟目的蛋白(poi)的下游核酸序列。在某些其他實(shí)施例或方面，包含本公開的變體核酸序列的多核苷酸可操作地連接到編碼蛋白質(zhì)信號(分泌)序列(ss)的下游(3′)核酸序列，該下游(3′)核酸序列可操作地連接到編碼成熟目的蛋白(poi)的下游核酸序列。在某些其他實(shí)施例或方面，包含本公開的變體核酸序列的多核苷酸可操作地連接到編碼蛋白質(zhì)信號(分泌)序列(ss)的下游(3′)核酸序列，該下游(3′)核酸序列可操作地連接到編碼前區(qū)(pro)序列的下游核酸序列，該下游核酸序列可操作地連接到編碼成熟目的蛋白(poi)的下游核酸序列。

5、在某些相關(guān)實(shí)施例中，poi選自由以下組成的組：酶、抗體、受體蛋白、凝集素和調(diào)節(jié)蛋白。

6、其他實(shí)施例提供了包含本公開的多核苷酸的表達(dá)盒。在相關(guān)實(shí)施例中，革蘭氏陽性細(xì)菌(宿主)細(xì)胞包含本公開的一個或多個引入的盒。在某些實(shí)施例中，革蘭氏陽性宿主細(xì)胞是芽孢桿菌屬物種細(xì)胞。在相關(guān)實(shí)施例中，芽孢桿菌屬物種(宿主)細(xì)胞選自由以下組成的組：枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌(b.licheniformis)、遲緩芽孢桿菌(b.lentus)、短芽孢桿菌(b.brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(b.stearothermophilus)、嗜堿芽孢桿菌(b.alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌(b.clausii)、耐鹽芽孢桿菌(b.halodurans)、巨大芽孢桿菌(b.megaterium)、凝結(jié)芽孢桿菌(b.coagulans)、環(huán)狀芽孢桿菌(b.circulans)、燦爛芽孢桿菌(b.lautus)、和蘇云金芽孢桿菌(b.thuringiensis)。

7、本公開的某些其他實(shí)施例提供了用于在革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中生產(chǎn)目的蛋白(poi)的方法，這些方法包括(a)向革蘭氏陽性細(xì)胞中引入表達(dá)盒，該表達(dá)盒包含seq?idno:8至seq?id?no:46中的任一個的變體核酸序列，該變體核酸序列可操作地連接到編碼目的蛋白(poi)的下游(3′)核酸序列；和(b)在適用于生產(chǎn)該poi的條件下培養(yǎng)該經(jīng)修飾的細(xì)胞。在這些方法的某些優(yōu)選實(shí)施例中，相對于(相比于)包含引入的表達(dá)盒的對照革蘭氏陽性細(xì)胞，經(jīng)修飾的細(xì)胞生產(chǎn)增加量的poi，該引入的表達(dá)盒包含可操作地連接到編碼相同poi的下游(3′)核酸序列的seq?id?no:1的參考核酸序列，其中在相同條件下培養(yǎng)經(jīng)修飾的細(xì)胞和對照細(xì)胞。在這些方法的某些其他實(shí)施例中，在培養(yǎng)至少約七十二(72)小時之后，相對于對照細(xì)胞，經(jīng)修飾的細(xì)胞生產(chǎn)增加量的poi。在這些方法的又其他實(shí)施例中，目的蛋白(poi)選自由以下組成的組：酶、抗體、受體蛋白、凝集素和調(diào)節(jié)蛋白。在這些方法的某些實(shí)施例中，酶選自由以下組成的組：乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、碳酸酐酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、凝乳酶、角質(zhì)酶、脫氧核糖核酸酶、差向異構(gòu)酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂合酶、內(nèi)切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡糖醛酸酶、糖基水解酶、半纖維素酶、己糖氧化酶、水解酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、漆酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化還原酶、果膠酸裂合酶、果膠乙酰酯酶、果膠解聚酶、果膠甲基酯酶、果膠分解酶、過水解酶、多元醇氧化酶、過氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其組合。在這些方法的某些其他實(shí)施例中，革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞是芽孢桿菌屬物種細(xì)胞。