本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種用于空間crispr篩選測序的直接捕獲sgrna探針及其應用。

背景技術：

1、生物系統在本質上呈現出顯著的空間有序性特征，細胞間的相互作用以及分子層面的各類過程均在特定的空間環(huán)境中展開。在空間生物學領域的眾多先進研究手段里，空間轉錄組學已充分展現出其強大的研究能力。它不僅能夠深入探究組織結構、空間維度下的基因表達模式，還可以對細胞群體以及細胞間的相互作用進行細致研究。然而，目前能夠在基因表達與空間表型的功能影響之間搭建起因果關聯的工具仍處于匱乏狀態(tài)，同時，驅動這些生物學過程的調控通路也遠未得到充分挖掘。

2、crispr-cas9技術通過sgrna介導cas9蛋白實現精準的基因組編輯，為功能基因組學研究帶來了革命性突破。該技術能夠將基因擾動與特定表型（如細胞生長、存活率、標志基因表達等）直接關聯，極大地推進了基因功能研究。隨著crispr篩選技術向高通量水平發(fā)展，研究人員得以系統性地探究基因功能。此外，單細胞rna測序（single-cell?rna-seq）技術的出現，使得在單細胞擾動條件下進行全轉錄組基因表達分析成為可能。其中，perturb-seq作為crispr介導的典型平臺，雖然在單細胞水平實現了基因擾動與轉錄組分析的整合，但其應用常受限于特定的質粒系統設計，需要在mrna中攜帶與sgrna對應的序列。10×genomics公司開發(fā)的直接捕獲sgrna的perturb-seq技術突破了這一限制，可兼容幾乎所有類型的sgrna表達質粒，推動了單細胞perturb-seq技術的廣泛應用，但在空間轉錄層面的應用仍存在明顯局限性。

3、當前，以單細胞全轉錄組為讀取輸出的高通量空間crispr篩選測序方法尚屬空白，在空間層面直接捕獲sgrna的方法也同樣缺失，這為空間生物學的進一步研究帶來挑戰(zhàn)的同時也為其創(chuàng)新發(fā)展提供了機遇。

技術實現思路

1、技術問題

2、本發(fā)明旨在開發(fā)一種超高重的靶向捕獲探針，通過結合空間轉錄組學，應用于空間crispr篩選測序。

3、技術方案

4、本發(fā)明第一方面提供了用于空間crispr篩選測序的直接捕獲sgrna探針，所述直接捕獲sgrna探針基于目標物種特定基因的sgrna序列設計；其中，所述直接捕獲sgrna探針包括左側探針和右側探針；所述sgrna包含支架序列和原間隔序列；其中，所述左側探針由核酸序列1和核酸序列2組成；所述右側探針由核酸序列3、核酸序列4及poly-a尾組成；其中，所述核酸序列1為二代測序所需的read2序列；所述核酸序列2與sgrna的支架序列5’端的6-30?bp序列反向互補；所述核酸序列3與sgrna的支架序列5’端的起始5?bp序列反向互補；所述核酸序列4與sgrna的原間隔序列反向互補。

5、在一些實施例中，所述左側探針和右側探針為dna；所述左側探針長度為46?bp，所述右側探針長度為55?bp；其中，所述核酸序列1長度為21?bp，所述核酸序列2長度為25?bp，所述核酸序列3長度為5?bp，所述核酸序列4長度為20~30?bp，所述poly-a尾的長度為至少20?bp。

6、在一些實施例中，當所述目標物種為小鼠時，所述右側探針中的核酸序列4長度為20?bp。

7、在一些實施例中，所述左側序列如seq?id?no.1所示，右側序列如seq?id?no.2~seq?id?no.121所示。

8、在一些實施例中，左側探針和右側探針在空間crispr篩選測序過程中通過t4連接酶的作用下進行夾板連接。

9、本發(fā)明第二方面提供了一種空間crispr篩選測序方法，包括如下步驟：s1：將含有crispr敲除文庫的目標細胞注入實驗動物體內；s2：取出目標細胞浸潤后的組織，制備石蠟切片，并進行he染色及成像；s3：成像后的組織切片經歷透化、解交聯后，與全轉錄組基因表達探針以及上述任意一項所述的直接捕獲sgrna探針進行探針雜交；雜交后的直接捕獲sgrna探針的左側探針和右側探針在t4連接酶的作用下進行夾板連接；s4：利用visium?hd進行空間mrna文庫構建和空間sgrna文庫構建；s5：分別對空間mrna文庫和空間sgrna文庫進行測序和基因序列比對，得到攜帶空間坐標的普通轉錄組測序數據和crispr?sgrna文庫測序數據。

10、在一些實施例中，所述含有crispr敲除文庫的目標細胞通過以下步驟獲得：制備crispr篩選文庫病毒，使受試細胞感染crispr篩選文庫病毒，分選出陽性感染的受試細胞并培養(yǎng)一段時間，獲得含有crispr敲除文庫的目標細胞。

11、在一些實施例中，所述注入實驗動物體內的方式為靜脈注入、皮下注入、肌肉注入或腫瘤注入。

12、在一些實施例中，所述組織為腫瘤組織或正常組織。

13、在一些實施例中，還包括將所述普通轉錄組測序數據和crispr?sgrna文庫測序數據根據相同的空間坐標，合并為同一張芯片的數據。

14、本發(fā)明第三方面提供了上述任意一項所述的直接捕獲sgrna探針在空間crispr篩選測序中的應用。

15、本發(fā)明第四方面提供了上述任意一項所述的空間crispr篩選測序方法在驗證基因功能中的應用。

16、本發(fā)明第五方面提供了上述任意一項所述的空間crispr篩選測序方法在探究腫瘤轉移機制中的應用。

17、在一些實施例中，對所述普通轉錄組測序數據進行無偏聚類，對聚類后的每一類與其他所有類做差異分析，得到每一類的標志性基因，作為每一類的關鍵特征；根據crisprsgrna文庫測序數據，對sgrna在不同聚類中的表達量進行差異分析，得到sgrna敲除基因的目標細胞傾向于富集的聚類，從而驗證sgrna靶標基因的功能。

18、技術效果

19、本發(fā)明通過超高重的靶向捕獲探針，結合空間轉錄組學開發(fā)的空間crispr篩選測序（spac-seq）技術是一種通用的空間crispr篩選技術，可兼容多種高通量、基于單細胞測序的空間轉錄組學平臺，包括10×genomics?visium?hd。

20、本發(fā)明提供的直接捕獲sgrna探針具有高度的特異性，具體地，兩個探針中，一個與sgrna的20?bp?protospacer進行互補配對，但存在同樣與該sgrna的靶基因對應的mrna互補配對，為了避免這種錯配，一方面，該sgrna特異性的探針仍有5?bp與sgrna的scaffold配對，并且更重要的，另一條互補后則完全相鄰的探針（帶有21?bp建庫必需序列并有25?bp互補配對在scaffold），可以在t4連接酶的催化下，與這條sgrna特異性的探針進行連接。連接成功后的探針，一方面具備了來自兩端的兩種探針各自互補配對的特異性，更重要的是，t4夾板連接保證了只有與按照參考序列設計出的一致的、兩條探針完全相鄰而非間隔的探針才可以連接。這兩方面的特異性使得所得到的探針產物一方面能識別sgrna的protospacer特異性序列，另一方面能識別sgrna而非靶基因的scaffold序列，另一方面是識別特異性序列和sgrna?scaffold序列的兩條探針在空間距離上必須完全符合預期，這三個特異性一起保證了探針的高度特異性。

21、許多單細胞crispr篩選和空間crispr篩選方法受限于特定的質粒設計。本發(fā)明提供的直接捕獲型spac-seq（direct?capture?spac-seq）克服了這一限制，就像直接捕獲型perturb-seq（direct?capture?perturb-seq）在單細胞crispr篩選領域的突破一樣。這一優(yōu)勢使spac-seq能夠應用于未來的空間研究，例如crispri/a、orf（開放閱讀框）篩選或其他空間條形碼篩選（spatial?barcoding?screens）。

22、本發(fā)明提供的直接捕獲型spac-seq是一種基于空間層面的單細胞crispr篩選測序方法，以空間全轉錄組作為所研究的生物學讀出信號，適用于研究基因功能，例如腫瘤轉移機制，具體地，本發(fā)明發(fā)現了icam1（胞間黏附分子1）是腫瘤播散后免疫監(jiān)視的關鍵調節(jié)因子。