本公開屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及靶向調(diào)控lpa基因表達(dá)的sirna雙鏈體及其在預(yù)防和治療心腦血管相關(guān)疾病中的用途。

背景技術(shù)：

1、核酸藥物尤其是寡核苷酸藥物，由于其合成簡單、活性較高而得到廣泛應(yīng)用。寡核苷酸藥物通常包括反義寡核苷酸（aso）、小干擾rna（sirna）、微小rna（mirna）和核酸適配體等。

2、寡核苷酸是一類短的dna或rna分子、寡聚體，寡核苷酸能夠以序列特異性的方式與各自的互補(bǔ)寡核苷酸、dna或rna結(jié)合，形成雙鏈體，或者，盡管較不常見，但有些情況下形成更高階的雜合體。寡核苷酸能夠序列特異性地與互補(bǔ)的rna鏈結(jié)合，雜交后能夠誘導(dǎo)rnase?h裂解靶rna。天然的寡核苷酸中，核苷酸之間由磷酸二酯鍵連接，在生理?xiàng)l件下，寡核苷酸對核酸酶特別敏感，因此在制備寡核苷酸藥物時(shí)，天然的、未經(jīng)改造的或未經(jīng)修飾的寡核苷酸在體內(nèi)容易被快速降解，因此能夠發(fā)揮的活性非常有限，因而成藥性差。對寡核苷酸進(jìn)行修飾是提高其活性的有效方式，可以提高其對核酸酶的穩(wěn)定性、與rna的親和性，并能更好地促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)吞和組織靶向，從而有效調(diào)控靶基因的表達(dá)。

3、核苷酸的基本結(jié)構(gòu)通?？蓜澐譃閴A基、核糖、磷酸骨架和末端四個(gè)部分，這四個(gè)部分的修飾可以舉例如下：

4、1）堿基的修飾：主要分為嘌呤修飾、嘧啶修飾以及堿基替換三種形式。嘌呤修飾包括n6-甲基腺苷、n1-甲基腺苷、7-甲基鳥苷酸修飾；嘧啶修飾包括3-甲基尿嘧啶核苷、5-甲基尿嘧啶核苷、5-甲基胞嘧啶核苷、n4?-乙酰胞苷、假尿苷、硫尿核苷、丙炔尿嘧啶核苷以及二氫尿嘧啶核苷等修飾。

5、2）核糖的修飾：主要分為核糖環(huán)特定位置處的基團(tuán)的修飾和替換等。核糖的修飾包括但不限于2’-位修飾、4’-位修飾、5’-位修飾、異構(gòu)修飾等。核糖2’-位修飾中最為常見的是2’-ome（2’-甲氧基）修飾及2’-f（2’-氟代）修飾。相比天然的寡核苷酸，同時(shí)采用2’-ome及2’-f修飾后的寡核苷酸具有更高的tm值、更強(qiáng)的血清穩(wěn)定性和更好的活性。

6、3）磷酸骨架的修飾：主要的修飾方式包括但不限于硫代磷酸酯的修飾；經(jīng)甲基磷酸酯、硒代磷酸酯、甲硼基磷酸酯、雙硫代磷酸酯，以及用硫原子取代磷酸二酯鍵連接區(qū)的橋氧原子修飾；將核苷之間的磷酸酯基整個(gè)替換為不含磷原子的基團(tuán)，如將p原子替換為c原子、s原子以及n原子等，從而形成胍基、s-甲基硫脲或硝酸酯等。

7、4）末端修飾：包括但不限于在正義鏈的5’末端和/或3’末端以共價(jià)鍵連接特定基團(tuán)、反義鏈5’末端磷酸化修飾等。

8、脂蛋白(a)(lipoprotein(a)，lp(a))是利用免疫方法發(fā)現(xiàn)的一種特殊類型的脂蛋白顆粒，其在心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用，是心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素。lp(a)由包含膽固醇、氧化磷脂（oxpl）等脂質(zhì)成分的ldl樣(ldl-like)顆粒與載脂蛋白a?(apo(a))以及載體蛋白b-100等組成，其中載脂蛋白b-100通過共價(jià)鍵與apo(a)結(jié)合。apo(a)是一種高度多態(tài)性的糖蛋白，其由lpa基因編碼。

9、目前認(rèn)為lp(a)通過多種方式促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊的形成。流行病學(xué)和遺傳學(xué)研究表明，lp(a)水平升高是引發(fā)心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，即使ldl-c水平被控制在當(dāng)前指南規(guī)定的最佳范圍內(nèi)，與lp(a)相關(guān)的心血管風(fēng)險(xiǎn)仍然存在。因此，抑制lpa基因的表達(dá)水平，能夠降低動脈粥樣硬化及其相關(guān)心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。能夠用于患有脂蛋白(a)相關(guān)疾病的患者的替代療法和組合療法是臨床上需要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)中缺乏一種更為有效的靶向調(diào)控lpa基因表達(dá)的sirna雙鏈體的技術(shù)問題，本公開提供了靶向調(diào)控lpa基因表達(dá)的sirna雙鏈體及其在預(yù)防和治療心腦血管相關(guān)疾病中的用途。本公開通過對sirna基礎(chǔ)序列進(jìn)行修飾，篩選出了多個(gè)對lpa基因表達(dá)具有顯著抑制作用的sirna修飾物，并且提供了相應(yīng)的sirna綴合物。

2、本公開的技術(shù)方案包括但不限于：

3、一方面，本公開提供了一種sirna雙鏈體，其包含由正義鏈和反義鏈配對組成的寡核苷酸雙鏈體。

4、另一方面，本公開提供了一種用于降低lpa的表達(dá)的綴合物，其包括上述sirna雙鏈體，及與其連接的綴合基團(tuán)。

5、另一方面，本公開提供了一種核酸蛋白復(fù)合物，其包含上述sirna雙鏈體的雙鏈區(qū)或雙鏈區(qū)的反義鏈，以及核酸酶。

6、另一方面，本公開提供了一種重組載體，包含編碼上述sirna雙鏈體的核酸分子。

7、一些實(shí)施方案中，所述重組載體的載體骨架選自重組類病毒衍生的環(huán)狀rna載體、trna、rrna支架和嵌合trna/pre-mi?rna載體。

8、另一方面，本公開提供了一種重組細(xì)胞，其合成并分泌上述sirna雙鏈體。

9、一些實(shí)施方案中，所述重組細(xì)胞選自嗜硫紅假單胞菌和核糖核酸酶iii缺陷的谷氨酸棒狀桿菌。

10、另一方面，本公開提供了一種制備sirna雙鏈體的方法，包括培養(yǎng)上述重組細(xì)胞，或化學(xué)合成。

11、另一方面，本公開提供了一種藥物組合物，其包括上述sirna雙鏈體、上述綴合物，或者上述核酸蛋白復(fù)合物，以及藥學(xué)上可接受的載體。

12、另一方面，本公開提供了一種抑制lpa基因表達(dá)的方法，包括將上述sirna雙鏈體、上述綴合物、上述核酸蛋白復(fù)合物、或上述藥物組合物與靶細(xì)胞接觸。

13、一些實(shí)施方案中，所述方法為非診斷或非治療目的的。

14、一些實(shí)施方案中，所述方法為體內(nèi)的或體外的。

15、另一方面，本公開提供了一種上述sirna雙鏈體、上述綴合物、上述核酸蛋白復(fù)合物、或上述藥物組合物在制備治療與lpa基因表達(dá)相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。

16、所述lpa基因表達(dá)相關(guān)疾病選自apo(a)蛋白過表達(dá)、lpa基因致病突變、apo(a)蛋白代謝異常、lpa或apo(a)與另一物質(zhì)的異常相互作用導(dǎo)致的疾病。

17、一些實(shí)施方案中，所述lpa基因表達(dá)相關(guān)疾病選自伯格氏病(berger’s?disease)、外周動脈疾病、冠狀動脈疾病、代謝綜合征、急性冠脈綜合征、主動脈瓣狹窄、主動脈瓣反流、主動脈夾層、視網(wǎng)膜動脈阻塞、腦血管疾病、腸系膜缺血、腸系膜上動脈阻塞、腎動脈狹窄、穩(wěn)定型/不穩(wěn)定型心絞痛、急性冠脈綜合征、雜合子或純合子家族性高膽固醇血癥、高載脂蛋白β脂蛋白血癥、腦血管動脈粥樣硬化、腦血管疾病和靜脈血栓形成、中風(fēng)、動脈粥樣硬化、血栓形成、冠心病或主動脈瓣狹窄和/或與lp(a)顆粒的水平升高相關(guān)的任何其他疾病以及其他尚未鑒定的相關(guān)病癥、病理或綜合征。

18、另一方面，本公開提供了一種上述sirna雙鏈體、上述綴合物、上述核酸蛋白復(fù)合物、或上述藥物組合物用于治療與lpa基因表達(dá)相關(guān)疾病。

19、另一方面，本公開提供了一種用于治療與lpa基因表達(dá)相關(guān)疾病的方法，包括向有需要的受試者施用有效量的上述sirna雙鏈體、上述綴合物、上述核酸蛋白復(fù)合物、或上述藥物組合物。

20、另一方面，本公開提供了一種上述sirna雙鏈體、上述綴合物、上述核酸蛋白復(fù)合物、或上述藥物組合物在制備預(yù)防或治療動脈粥樣硬化和心腦血管疾病藥物中的應(yīng)用。

21、另一方面，本公開提供了一種上述sirna雙鏈體、上述綴合物、上述核酸蛋白復(fù)合物、或上述藥物組合物用于預(yù)防或治療動脈粥樣硬化和心腦血管疾病。

22、另一方面，本公開提供了一種用于預(yù)防或治療動脈粥樣硬化和心腦血管疾病的方法，包括向有需要的受試者施用有效量的上述sirna雙鏈體、上述綴合物、上述核酸蛋白復(fù)合物、或上述藥物組合物。

23、本公開所取得的有益效果至少如下：

24、（1）sirna基礎(chǔ)序列，例如sirna?b01001、b01023、b01042、b01047、b02417、b06001、b01801、b01012，對lpa基因均具有顯著抑制作用，抑制率最高可超過50%。

25、（2）本公開的sirna修飾物對于lpa基因的抑制率最高可達(dá)70%以上。并且，修飾物與galnac綴合基團(tuán)連接后形成相應(yīng)的sirna綴合物，可以高效遞送至動物肝臟，并顯著抑制lpa基因，顯著降低血清lp(a)蛋白水平。

26、（3）本公開采用交替修飾和本公開修飾模板修飾的各序列，同現(xiàn)有技術(shù)公開的序列差異很小的sirna相比，對lpa抑制活性均顯著提升，最多可提高36.0%。