本發(fā)明屬于天然活性物質(zhì)提取純化，尤其是一種基于黑西洋參的抗炎活性類黑精及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、類黑精(melanoidins)是一類復(fù)雜的高分子量化合物，主要是在美拉德反應(yīng)的最終階段形成。它們廣泛存在于多種食品和藥材中，如咖啡、黑茶、黑蒜、發(fā)酵食品等，賦予其特有的顏色、風(fēng)味和生物活性。近年來，隨著對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的深入研究，類黑精因其優(yōu)異的抗氧化、抗菌、抗炎及腸道健康調(diào)節(jié)等功能，受到了食品科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。

2、炎癥是機體應(yīng)對感染、損傷和其他刺激的一種防御機制，但慢性炎癥則可能導(dǎo)致組織損傷，并與糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病等慢性疾病密切相關(guān)。研究表明，類黑精在體內(nèi)外實驗中均能發(fā)揮抗炎作用，其作用機制主要包括：抑制促炎因子的釋放、抑制氧化應(yīng)激以及調(diào)控炎癥信號通路。而炎癥介質(zhì)是指在炎癥過程中由細胞釋放的一類生物活性分子，能夠調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、細胞通訊和組織修復(fù)。根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，炎癥介質(zhì)主要包括細胞因子(cytokines)、趨化因子(chemokines)、花生四烯酸衍生物(如前列腺素和白三烯)以及一氧化氮(no)等。不同類型的炎癥介質(zhì)在不同病理環(huán)境下可能具有促炎或抗炎作用，影響炎癥的持續(xù)時間和嚴重程度。在體外細胞實驗中，黑蒜類黑精能夠顯著抑制lps誘導(dǎo)的巨噬細胞炎癥反應(yīng)，降低tnf-α、il-6和il-1β的表達。此外，類黑精還能通過抑制nf-κb和mapk信號通路，減少炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和釋放，從而減輕炎癥反應(yīng)。并且，茶類黑精能夠降低cox-2和inos的表達，減少前列腺素e2(pge2)的合成，緩解炎癥相關(guān)疾病的癥狀。類黑精的攝入可顯著降低炎癥小鼠模型中的血清c反應(yīng)蛋白(crp)水平，并減少肝臟和腸道的氧化損傷。此外，類黑精在關(guān)節(jié)炎和神經(jīng)炎癥方面的研究也顯示出潛在的應(yīng)用價值，這使其成為天然抗炎食品或藥物的重要候選物。

3、類黑精提取法常應(yīng)用在于分離純化前，根據(jù)在某一特定溶劑中樣品各成分溶解度不同的原理，選擇合適的有機溶劑將類黑精分離，目前比較常用的有機溶劑包括甲醇、乙醇、乙醚、氯仿、丙酮等。當(dāng)選擇有機溶劑時，應(yīng)該特別注意它們的毒性和安全性。此外溶劑濃度范圍也需要實驗商榷，若濃度過小，會導(dǎo)致提取效率降低；如果溶劑濃度過大，類黑精的提取時間會相應(yīng)延長，會發(fā)生浸出的雜質(zhì)增多的問題，且浸出的類黑精會一定程度上抑制還未浸出物質(zhì)。乙醇浸提法是將乙醇溶液作為溶劑對物質(zhì)進行分離提純的方法，在類黑精提取中較為常見。適當(dāng)體積分數(shù)的乙醇溶液對類黑精的提取起促進作用，有利于類黑精的結(jié)構(gòu)及功能的穩(wěn)定性，此外還能使得一些水溶性蛋白和雜質(zhì)沉淀，使提取的類黑精純度更高。

4、類黑精的分離純化主要以分子量大小和極性大小進行分離，這些分離方法主要包括透析、超濾、分子排阻色譜、大孔樹脂分離、高效液相色譜等。在多種不同的分離純化方法中，透析和超濾是最簡單高效的方法，常常用來分離純化活性物質(zhì)。透析法的原理是溶液中分子按分子量大小不同在半透膜中的透過性將小分子物質(zhì)和大分子物質(zhì)分離開來，具有操作便捷的優(yōu)點。而大孔樹脂具有選擇性好、吸附速度快、時間短的優(yōu)點，且凝膠層析在純化物質(zhì)方面應(yīng)用十分廣泛，它是根據(jù)被純化物質(zhì)的大小和形狀進行分離。親水凝膠為情性載體，不帶電荷，凝膠表面分布著各種大小不一的微孔，當(dāng)樣品注入層析柱中，不能進入微孔的大分子率先洗脫出來，進入微孔的小分子后被洗脫出來。

5、因此，利用多重分離純化技術(shù)對食品物料中類黑精能夠簡便高效的分離提取，分離不同極性及分子量的類黑精，提高食物類黑精的得率，縮短類黑精的提取時間、增加提取效率，減少對類黑精結(jié)構(gòu)或活性的破壞以及更適合于規(guī)?；a(chǎn)，受到廣泛關(guān)注。

6、因此，開發(fā)一種基于黑西洋參的抗炎活性類黑精及其制備方法和應(yīng)用，對于解決技術(shù)上存在的諸多問題具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種基于黑西洋參的抗炎活性類黑精及其制備方法和應(yīng)用。

2、本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

3、一種基于黑西洋參的抗炎活性類黑精，所述抗炎活性類黑精通過金屬螯合分離純化制得，其具有如下特性：

4、(i)抗炎活性類黑精含量為63.29～73.52g/100g；

5、(ii)抗炎活性類黑精的分子量分布范圍為4.6×102～2.49×104da；

6、(iii)抗炎活性類黑精呈現(xiàn)均勻的棒狀和片狀微觀結(jié)構(gòu)；

7、(iv)抗炎活性類黑精中的骨架富含c＝o、c-n和n-h基團，分離后的類黑精分離后產(chǎn)物在1600cm-1處出現(xiàn)酰胺和羧基的特征吸收峰。

8、進一步地，所述抗炎活性類黑精的基本組成中總糖的含量為13.21％～15.55％，蛋白質(zhì)的含量為0.89％～1.03％，脂質(zhì)的含量為1.24％～1.95％，灰分的含量為3.26％～3.68％。

9、如上所述的抗炎活性類黑精在作為活性組分在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。所述體外抗炎活性選用結(jié)腸癌caco-2細胞模型。

10、如上所述的抗炎活性類黑精作為功能配料在制備功能性食品及抗炎藥品中的應(yīng)用。

11、如上所述的抗炎活性類黑精的制備方法，包括如下步驟：

12、(1)將西洋參置于流化床氣流粉碎機中進行粉碎，將粉碎后的西洋參粉末蒸制3～4h，曬干，重復(fù)九次，最后置于50～60℃下真空干燥，得到黑西洋參粉末；

13、(2)將黑西洋參粉末加入乙醇溶液中混合均勻，置于恒溫水浴鍋中磁力攪拌30～70min，離心，重復(fù)2～5次，合并上清液減壓濃縮，冷凍干燥得到類黑精粗提物；

14、(3)將得到的類黑精粗提物溶解于蒸餾水中得提取液，并加入金屬氯化物，攪拌均勻，用2m?naoh調(diào)節(jié)ph值，室溫下進行磁力攪拌后靜置12～14h，形成紅棕色沉淀，離心收集沉淀；

15、(4)所得沉淀加入金屬螯合劑處理，在50℃水浴下磁力攪拌3～4h，除去添加的金屬離子后，進行透析、除蛋白、減壓濃縮，然后凍干得到類黑精；

16、(5)大孔樹脂純化：將凍干后的類黑精，用超純水復(fù)溶后過0.45μm濾膜，用大孔樹脂進行吸附，設(shè)置濃度梯度為0、20％、40％、60％的乙醇溶液進行梯度洗脫，收集洗脫液，在420nm波長下檢測吸光值，收集洗脫液并濃縮除去溶劑，冷凍干燥；

17、(6)葡聚糖凝膠柱層析純化：將步驟(5)所得凍干物配制成類黑精水溶液，采用超純水作為洗脫劑平衡葡聚糖凝膠柱層析柱，上樣于層析柱頂部進行梯度洗脫，控制洗脫流速，自動收集洗脫液，在420nm下測定洗脫液的吸光度值，并采用半制備高效液相色譜進行測定，合并相同餾分的洗脫液，減壓濃縮，凍干后即制得基于黑西洋參的抗炎活性類黑精。

18、進一步地，步驟(1)中所述流化床的氣流速度為300～500m/s，氣流壓力為0.6～1.2mpa，黑西洋參粉末的粒徑為60～100μm；

19、或者，步驟(2)中所述乙醇溶液的體積濃度為0～50％，取值不為0，黑西洋參粉末與乙醇溶液的料液比為1:5～1:25，恒溫水浴鍋的水浴溫度為30～70℃。

20、進一步地，步驟(2)、(4)中減壓濃縮的壓力為0.05～0.1mpa，溫度為40～50℃；

21、或者，步驟(3)中類黑精粗提物與蒸餾水的料液比為1:20～1:25；每200ml提取液中金屬氯化物的添加量為5～7g；調(diào)節(jié)ph值為3.8～4.2；磁力攪拌時間為15～20min。

22、進一步地，所述步驟(3)中金屬氯化物包括fecl3、cocl2或nicl2。

23、進一步地，步驟(4)中金屬螯合劑為7.5％(w/v，質(zhì)量濃度)乙二胺四乙酸二鈉鹽(edta-2na)或乙二胺四乙酸四鈉鹽；金屬螯合劑和添加量為每8g類類黑精粗提物中加入200ml金屬螯合劑。

24、進一步地，步驟(4)中透析中選用1000da的透析袋；

25、或者，步驟(5)中大孔樹脂選用d101，洗脫流速為1～2.5ml/min，上樣濃度為15～25mg/ml；

26、或者，步驟(6)中葡聚糖凝膠層析柱選用葡聚糖凝膠g-50，洗脫流速為1～2ml/min，上樣濃度為80～120mg/ml。

27、本發(fā)明取得的優(yōu)點和積極效果為：

28、1、本發(fā)明以鮮西洋參為原料通過流化床氣流粉碎技術(shù)進行粉碎，并經(jīng)過反復(fù)蒸曬得到黑西洋參粉末，采用水提法提取類黑精并利用類黑精的金屬螯合性對類黑精進行分離純化。采用流化床氣流粉碎技術(shù)后黑西洋參中類黑精的含量顯著提升，并且與未分離純化類黑精相比，類黑精含量從42.27g/100g提高至73.52g/100g，是粗類黑精含量的1.7倍。

29、2、本發(fā)明利用類黑精的金屬螯合性進行分離純化，分離后產(chǎn)物的平均分子量為17.46kda，顯示出分離過程對高分子量成分的富集作用，分子量分布范圍為4.6×102～2.49×104da。在微觀結(jié)構(gòu)上，分離前的類黑精由不規(guī)則顆粒狀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為呈現(xiàn)均勻的棒狀和片狀結(jié)構(gòu)，且分離后產(chǎn)物在1600cm-1處出現(xiàn)酰胺和羧基等特征吸收峰，揭示了分離產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特點。

30、3、本發(fā)明中以黑西洋參為原材料，進行分離純化制備而成的類黑精具有良好的抗炎活性，能夠顯著抑制lps誘導(dǎo)的caco-2細胞中tnf-α、il-6、il-1β等炎癥因子的分泌。與lps相比，caco-2細胞中tnf-α、il-6、il-1β的濃度分別從10.89、7.38、13.77pg/ml降低至8.28、4.83、6.03pg/ml，il-1β下降了兩倍以上。此外，rt-qpcr分析進一步證明了黑西洋參類黑精降低了炎癥相關(guān)基因的mrna表達水平，其中inos的mrna表達水平從1.65下降至0.85，下降近兩倍。本發(fā)明通過金屬螯合分離純化得到的類黑精作為一種功能性成分來抑制炎癥反應(yīng)，一方面有效提高了類黑精的含量，另一方面，為類黑精在功能性食品和藥物中的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)和實踐指導(dǎo)。

31、4、本發(fā)明利用類黑精金屬螯合性進行分離純化，得到具有抗炎活性的黑西洋參類黑精。所述抗炎活性類黑精含量為63.29～73.52g/100g，分子量分布范圍為0.66～9682.78kda，平均分子量為17.46kda，且呈現(xiàn)均勻的棒狀和片狀結(jié)構(gòu)；抗炎活性的黑西洋參類黑精中的骨架富含c＝o、c-n和n-h基團，分離后產(chǎn)物在1600cm-1處出現(xiàn)酰胺和羧基等特征吸收峰，并通過體外細胞實驗探究其對lps誘導(dǎo)的caco-2結(jié)腸癌細胞的影響，研究結(jié)果表明類黑精分離物具有較為顯著的抗炎效果。