本發(fā)明關(guān)于一種具有突變的α-1-抗胰旦白酶編碼序列的大腸桿菌表達(dá)載體，這種突變導(dǎo)致了一種變異的α-1-抗胰旦白酶表達(dá)水平的增加。

α-1-抗胰旦白酶（AAT）是存在于血清和多種其他體液中的一種α-1-球旦白。在肝臟中合成時，成熟的AAT是一種分子量為50，000到55，000道爾頓的糖旦白。可以被AAT所抑制的旦白水解酶包括胰旦白酶，胰凝乳旦白酶，胰彈性旦白酶，皮膚膠原酶，血管緊張肽原酶和尿激酶以及多形核淋巴細(xì)胞的旦白水解酶。人體中AAT的遺傳缺陷往往同多種病理狀態(tài)聯(lián)系在一起，特別是肺氣腫和肝病。例見Morse，英國醫(yī)學(xué)雜志（N.Eng.J.Med.）299（19）：1045-1048（1978）和299（20）：1099-1105（1978）;Tobin等，Arch.Int.Med143（7）：1342-1348（1982）;以及Carrell等，自然（Nature）298（5872）：329-334（1982）。

彈性旦白酶是一種破壞肺組織的旦白酶，它的活性如不被抑制則會導(dǎo)致肺氣腫。例如在Gadek等美國呼吸疾病年簽（Am.Rev.Respir.Dis.），127S45（1983）和Glaser等美國呼吸疾病年簽，127：547-553（1983）的文章中已經(jīng)闡明AAT可以用于治療肺氣腫。

由于它可以用于治療而且對某些適應(yīng)癥，例如對ATT遺傳缺陷病人以補(bǔ)償治療時需要的量比較大;因此科研工作者一直在尋求一種大量生產(chǎn)AAT的技術(shù)。這種技術(shù)習(xí)慣上包括從血漿中提純AAT。例見Coan等，美國專利4，379，087。

Courtney等在EP-A-114，777中公開了缺失AATN-末端谷氨酸的一種AAT融合旦白在大腸桿菌中的表達(dá)。Courtney等還報告，在大腸桿菌中非融合AAT的表達(dá)十分低。

Courtney等在Nature，313：149（1985）中報告在大腸桿菌中具有活性位點(diǎn)突變的變異AAT的合成。

Bollen等在比利時專利895，961中報導(dǎo)了AAT克隆至大腸桿菌一種質(zhì)粒pULB1523中，這種質(zhì)粒由人肝細(xì)胞產(chǎn)生的多聚腺苷酸-核糖核酸（polyA-RNA）逆轉(zhuǎn)錄的cDNA（互補(bǔ)脫氧核糖核酸）1.4千堿基對片段克隆至pBR322質(zhì)粒PstI酶切位點(diǎn)而形成。Bollen等還闡明，cDNA片段包括整個AAT基因及其天然翻譯起始密碼。

Bollen等人在DNA（脫氧核糖核酸）2∶255（1983）的文章中，報導(dǎo)了pULB1523和pKT287這是一種導(dǎo)致在大腸桿菌中表達(dá)β-內(nèi)酰胺酶-AAT融合旦白質(zhì)的表達(dá)載體。

Bollen等在歐洲生物化學(xué)通信（FEBSLetters）116（1）：67-70（1984）中報導(dǎo)了利用λ啟動子PR在大腸桿菌中表達(dá)AAT。而試圖證明大腸桿菌來源的AAT的生物活性未能成功。

Parker等在澳大利亞專利申請31801/84中，報導(dǎo)了AAT在大腸桿菌中的表達(dá)。

Munson等在微生物學(xué)雜志（J.Microbiol.）177：663-683（1984）的文章中報告了大腸桿菌LacZ基因的突變導(dǎo)致β-半乳糖苷酶表達(dá)的增加。Myers等在Scierce，229：242（1985）文章中報告了在沒有表型選擇的條件下，確定突變DNA分子的電泳步驟。

一方面，本發(fā)明是一種由突變的AAT編碼序列組成的重組DNA分子，其中突變由AAT編碼序列的1-15密碼子內(nèi)的一種變化組成，假定突變是除外或附加以ATG密碼取代天然編碼序列的第一個密碼子。

另一方面，本發(fā)明是一種具有插入DNA分子的大腸桿菌表達(dá)載體和一種用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌。本發(fā)明也是一種生產(chǎn)具有AAT生物活性，即抗胰旦白酶和抗彈性旦白酶活性多肽的方法，其中包括在允許的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化大腸桿菌和分離這樣產(chǎn)生的AAT。

再一方面，本發(fā)明是一種變異AAT旦白，它具有AAT生物活性，但在1-15位內(nèi)氨基酸序列有改變，并假定這種改變是除外或附加成熟AAT第一位上的谷氨酸殘基的取代;本發(fā)明是一種抑制動物包括人肺的彈性旦白酶活性的藥物，它由這種變異了的AAT旦白質(zhì)和藥用的載體所組成;本發(fā)明也是一種抑制動物包括人肺彈性旦白酶活性的方法，這種方法包括給動物服用有效劑量的抗彈性旦白酶變異AAT旦白質(zhì)。

還有一方面，本發(fā)明還包括鑒定一種感興趣的突變的多肽編碼序列方法，突變序列使得轉(zhuǎn)錄和翻譯在數(shù)量上大于天然編碼序列;其要點(diǎn)可以歸納為（Ⅰ）將整個或部分天然編碼序列與一種帶有可選擇的表型的編碼序列相連接，轉(zhuǎn)化到合適的宿主里，并使翻譯融合物有一定量的表達(dá);（Ⅱ）誘變感興趣的多肽的整個或部分編碼序列;（Ⅲ）測定突變的轉(zhuǎn)譯融合的表達(dá)比原轉(zhuǎn)譯融合表達(dá)的增加;（Ⅳ）確定在（Ⅲ）中顯示增加表達(dá)的融合體里感興趣的多肽編碼序列突變部分的核苷酸序列，并且選擇那些感興趣的多肽編碼序列上有突變的核苷酸序列;（Ⅴ）制備一種與感興趣的產(chǎn)物的天然編碼序列相同的編碼序列，鑒定在突變的編碼序列上含有一個或多個突變的除外，并轉(zhuǎn)化至一種適當(dāng)?shù)乃拗髦?（Ⅵ）從（Ⅴ）挑選突變編碼序列，轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯在量上超過天然編碼序列的轉(zhuǎn)化子克隆。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過改變成熟AATN-末端編碼序列可以顯著地、出乎予料地改進(jìn)有活性的AAT在細(xì)菌中的表達(dá)，并且不破壞旦白質(zhì)的生物活性，即通過旦白質(zhì)抑制作用而不破壞旦白酶特別是彈性旦白酶。采用本發(fā)明的重組DNA分子，具有抗胰旦白酶和抗彈性旦白酶活性的變異AAT旦白在細(xì)菌中表達(dá)水平，要比天然AAT高二倍或更多。在本發(fā)明更好地實施時，變異AAT表達(dá)量可以是天然AAT的100倍甚至更高。如下面表1所示，天然AAT或這里所用的AAT是成熟的AAT，這種AAT以谷氨酸-門冬氨酸-脯氨酸作為N-末端氨基酸，并且通過在谷氨酸和門冬氨酸之間的BamHI位點(diǎn)切開天然編碼序列得到甲硫氨酸-門冬氨酸-脯氨酸的結(jié)構(gòu)。見下面實例2。如這里所列，變異的AAT具有和天然AAT不同的一級氨基酸順序。如下面表1所示，突變的AAT編碼序列是一個不同于天然AAT的編碼序列。因此，本發(fā)明的重組DNA分子是既可以分離出來，又可以包含在一種DNA大分子例如克隆或表達(dá)載體中的突變編碼序列。本發(fā)明的重組DNA分子可以采用標(biāo)準(zhǔn)合成或遺傳工程技術(shù)或者按下述解釋那樣合并使用二種方法來制備。

包含在本發(fā)明重組DNA分子中的編碼序列具有不影響氨基酸順序的一個或多個堿基對取代，和/或在頭十五個密碼子內(nèi)發(fā)生取代、加入或缺失一個或多個密碼子。在本發(fā)明示例的重組DNA分子中變異的AAT編碼序列，其結(jié)構(gòu)以及應(yīng)用在此示范，已在表1闡明，然后和天然AAT的頭20個密碼子作比較。變化的堿基對記錄下來。

利用本發(fā)明的重組DNA分子在大腸桿菌中表達(dá)的AAT或變異AAT的數(shù)量，以總細(xì)胞旦白質(zhì)百分比的形式列于后面表2中。所有這里列出來的質(zhì)粒表達(dá)載體，除了標(biāo)有“Cro”的以外，都采用了λ左邊的啟動子（PL）和CII核糖核旦白體結(jié)合點(diǎn)。Cro載體采用PL和Cro核糖核旦白體結(jié)合點(diǎn)。質(zhì)粒的構(gòu)建在下述例子中敘述，利用萘啶酮酸誘導(dǎo)或在括號內(nèi)的數(shù)據(jù)是通過熱誘導(dǎo)可以得到所報導(dǎo)的代表性表達(dá)資料。見Mott等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，82：88（1985）。表2也指出了對每個載體的產(chǎn)物所給予的名稱。

當(dāng)采用熱誘導(dǎo)時（例如見M.Rosenberg等酶學(xué)方法（Meth.Emzymol.）101：123-138（1983））AAT的形成量大約是萘啶酮酸誘導(dǎo)AAT形成量的1/3。例如采用pOTSα1Bcl，變異的AAT表達(dá)量為總細(xì)胞旦白質(zhì)的5-10%，而采用pα1-AGcro，則為2-4%，采用pHJα1-7為3-5%。

這里只闡明上述的重組DNA分子。采用分子遺傳學(xué)領(lǐng)域已知的技術(shù)可以使密碼子缺失和堿基對取代增加或改變。這種突變對在細(xì)菌中表達(dá)水平的作用已經(jīng)可以通過已知技術(shù)例如ELISA進(jìn)行了測定。例如Bollen等，脫氧核糖核酸（DNA），2：255（1983）所報導(dǎo)的。采用如Courtney等EP-A-114，777;Kawasaki等EP-A-103，409;和Travis，美國專利4，493，891所敘述的抑制彈性旦白酶和胰旦白酶的篩選方法，已經(jīng)可以測定所得旦白質(zhì)的活性。本發(fā)明闡明的其他DNA分子是這樣的分子，即通過取代一個或多個堿基對，引起AAT氨基酸序列改變，是不同于天然ATT的突變編碼序列分子。

包括在本發(fā)明中的還有在AAT編碼序列內(nèi)，除了AAT編碼序列5′-末端突變外的其他突變重組DNA分子。例如編碼序列可以在5′和/或3′-末端融合到為一種或多種外加的氨基酸或多肽編碼的序列上。例如質(zhì)粒pHJα1-2和-4中，N-末端甲硫氨酸融合或如Courtney等人在EP-A-114，777或Bollen等在脫氧核糖核酸，2：255（1983）所敘述的融合。流感病毒NS1，編碼序列N-末端融合至真正的AAT，可以增加雜交AAT的表達(dá)。編碼序列也包括除了5′-末端外的編碼序列區(qū)域中，密碼子的缺失或堿基取代。當(dāng)然，本發(fā)明排除了導(dǎo)致低于天然編碼序列表達(dá)水平的突變，即在大腸桿菌中，表達(dá)低于總細(xì)胞旦白質(zhì)的0.3%，或者產(chǎn)生的旦白質(zhì)失去生物學(xué)活性，如移碼突變，無意義突變或影響活性的活性點(diǎn)突變。Courtney等在自然（Nature）313：149（1985），和S.Rosenberg等在自然（Nature）312：1（1984）所闡明的可采用的活性點(diǎn)突變例子是在358位甲硫氨改變?yōu)槔i氨酸殘基。本發(fā)明的變異AAT，也可以如Mitra在美國專利4，496，689所敘述那樣，與其他分子相結(jié)合或混合。

如前所述，采用熟知的技術(shù)，可以在AAT編碼序列5′末端以及其他部位發(fā)生突變作用。為了回顧某些有用的技術(shù)，可以看Botstein等人科學(xué)（Science），229：1193（1985）的文章。例如這些包括了在選擇性地用一種外切酶如Bal31或綠豆核酸酶處理后，再采用限制性內(nèi)切酶處理編碼序列以使密碼子缺失。在缺失以后，合成的序列可以插入，以全部或部分取代缺失區(qū)。換言之，例如用化學(xué)誘變劑或輻射處理帶有一種ATT編碼序列的轉(zhuǎn)化子，則可以誘導(dǎo)突變。通過前20個密碼子的核苷酸序列和AAT的表達(dá)，可以挑選出5′-位置變化的突變株。采用AAT編碼序列N-末端的融合，即一種可選擇表型，如半乳糖激酶，和β-半乳糖苷酶，基因上行方向BamHI-BcLI45個堿基對片段，并篩選up-mutations，則可以很方便地進(jìn)行這種誘變實驗，也就是說，突變的出現(xiàn)增加了選擇表型基因的表達(dá)水平。

因此，從另一方面來說，本發(fā)明對于在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上高于天然編碼序列的突變的任何感興趣的多肽而言，是一種確定編碼序列突變的方法。把感興趣的產(chǎn)物的全部或部分天然編碼序列連接到已有選擇功能的編碼序列5′或3′末端，從而使得這種方法能夠進(jìn)行。而最好天然編碼序列部分是來自5′-末端的一部分，例如45個堿基對，將它與作為選擇功能的編碼序列5′-末端融合。

選擇功能是提供選擇表型的，并且最好其表達(dá)可以相對定量的任何功能。例如半乳糖激酶活性可以作為選擇表型，在麥康凱半乳糖（Difco）指示平板上，通過顏色變化使它的相對表達(dá)可以被定量。又如Heusterspreute等在脫氧核糖核酸（DNA），3：377-386（1984）文章中，敘述了乳糖激酶翻譯融合。其他例子包括β-半乳糖苷酶活性，在含有X-GaL或ONPG營養(yǎng)瓊脂的指示平板上，通過顏色變化可以相對定量這種酶活性。（例如見J.H.Miller，分子生物學(xué)實驗（ExperimentinMolecularBiology），冷泉港實驗室，紐約1972）。

這樣的翻譯融合物再誘變，例如通過一種誘變菌株或在體外采用如Munson等，微生物學(xué)雜志（J.Microbiol）177：663-683（1984）所敘述的誘變劑，例如羥胺進(jìn)行處理。也可參照J(rèn).H.Miller，分子生物學(xué)實驗，冷泉港實驗室，紐約，1972?？寺⊥蛔兊霓D(zhuǎn)化子，或用誘變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化過的宿主，并篩選選擇功能增加的表達(dá)。從顯示表達(dá)增加的克隆中分離質(zhì)粒，并分析感興趣多肽編碼部分脫氧核糖核酸序列。誘變某些質(zhì)粒中感興趣的產(chǎn)物的編碼序列。采用標(biāo)準(zhǔn)合成方法/重組DNA技術(shù)將突變部分插入感興趣的產(chǎn)品的整個編碼序列中。將這種突變編碼序列插入一種表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)入一種宿主細(xì)胞?？寺∞D(zhuǎn)化子，并檢測有用多肽的表達(dá)。有某些情況下，可以發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)粒中無關(guān)的突變會引起表達(dá)的增加。如同pHJα1-7情況一樣，這種突變可以與單一變異的編碼序列相結(jié)合。見下面例9。

突變AAT編碼序列插入到表達(dá)載體，用來制備本發(fā)明載體，這種表達(dá)載體可以是已知的、并是適用于本范圍的。許多細(xì)菌的表達(dá)載體最好選擇可以調(diào)節(jié)的表達(dá)載體，“調(diào)節(jié)”意味著插入的編碼序列的轉(zhuǎn)錄沒有被取代，但是可以被誘導(dǎo)，例如，通過加熱或者在培養(yǎng)基中加入誘變劑。其他典型的大腸桿菌表達(dá)載體有Bollen等在歐州生化學(xué)會通信（FEBS.Lett.）。166：67（1984）提到的pCQV2M.Rosenberg等在酶學(xué)方法（Meth.Enzym.）101：123-138（1983）提到的pAS1。pAS1帶有pBR322的復(fù)制起始區(qū)，抗氨芐青霉素標(biāo)志以及一系列λDNA片段，包括調(diào)節(jié)區(qū)，名為λ左側(cè)啟動子（PL），N抗-終止作用識別位點(diǎn)（NutL和NutR），依賴于rho的轉(zhuǎn)錄終止信號（tR1）和包括cII翻譯起點(diǎn)在內(nèi)的cII核糖核旦白體結(jié)合位點(diǎn)，以及后面緊接有BamHI酶切位點(diǎn)的G殘基，如下：

5′……CATATG＊GATCC……3′

這里，＊表示BamHI的酶切位點(diǎn)。

由于在cⅡ-pBR322上使pKC30cⅡ連到cⅡATG處的BamHI位點(diǎn)核苷酸的缺失，并通過再次連接使分子在ATG下游緊接著重新產(chǎn)生BamHI位點(diǎn)，由pKC30cⅡ得到pAS1。將帶有cⅡ基因的λDNA1.3kb（千堿基）的HaeⅢ片段插入pKC30的HpaI位點(diǎn)，構(gòu)成了pKC30cⅡ。見上述Shatzman等基因表達(dá)實驗操作（“ExperimentalManipulationofGeneExpression”），由M.Inouye主編，科學(xué)社出版，紐約（1983）及M.Rosenberg等上述引用文章。Shimitake等在自然（Nature）292：128（1981）中敘述了pKC30。它是在pBR322質(zhì)?？顾沫h(huán)素基因部位BamHⅠ和HindⅢ位點(diǎn)間插入了λDNA2.4kb（千堿基）HindⅢ-BamHⅠ片段的一種pBR322衍生物。Courtney等在自然313：149（1985）和Kotewice等在基因（Gene）35：249（1985）都敘述了類似pAS1的構(gòu)建。即采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，按照調(diào)節(jié)因子正確的方向和適當(dāng)?shù)拈喿x框架將編碼序列有效地插入。

其它的克隆和表達(dá)體系，對于本發(fā)明的成熟的ATT編碼序列，在別的微生物如芽胞桿菌、鏈霉菌、棒狀桿菌及其它菌中的表達(dá)，是已經(jīng)知道的，也是有用的。

采用從肝細(xì)胞mRNA總體進(jìn)行選擇地逆轉(zhuǎn)錄的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可以得到成熟、天然AAT的編碼序列，其中天然存在的多態(tài)性的任何一種都可以作為本發(fā)明的原材料，例如已經(jīng)由Bollen等在比利時專利895，961;Bollen等在脫氧核糖核酸3：255（1983）;Courtney等在Ep-A-114，777;Kawasaki等在“酵母的分子生物學(xué)”8月，16-21，1983;冷泉港實驗室;Long等在基因的結(jié)構(gòu)和組織，Ⅰ摘要No25（1983）;Woo等在“從基因到旦白質(zhì)：翻譯為生物技術(shù)”由Ahmed等主編，科學(xué)出版社，紐約（1982）;Kurachi等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：6826（1981）;Parker等澳大利亞專利申請31801/84，以及Costanzo等在歐州分子生物學(xué)雜志2：57（1983）。在上列的文獻(xiàn)中似乎都進(jìn)行了充分闡述。

根據(jù)本發(fā)明的步驟，在允許條件下，用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或微生物進(jìn)行培養(yǎng)，可以得到變異的AAT。“允許條件”意味著培養(yǎng)條件即：可以使AAT誘導(dǎo)表達(dá)的條件如分析，代謝，其它培養(yǎng)基配方以及溫度。經(jīng)典的是在含有可吸收碳源、氮源的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，在攪拌和選定的壓力下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌直至誘導(dǎo)前的對數(shù)生長期。（A650大約為0.4-0.6），誘導(dǎo)后再培養(yǎng)1.5至5小時直至有可回收量多肽被表達(dá)為止。

在大腸桿菌或其他生物中表達(dá)的本發(fā)明變異AAT，可以采用標(biāo)準(zhǔn)旦白質(zhì)分離技術(shù)從培養(yǎng)液中分離出來。典型的提純方案包括：（1）破壞細(xì)胞（2）澄清細(xì)胞提取液（3）分離變異的AAT分子（4）除去殘留污染物包括殘留多肽、碳水化合物、核酸和/或脂多糖以進(jìn)行最后純化。

第一個步驟可以加入溶菌酶或者其他溶菌、或滲透性試劑，或者采用機(jī)械或超聲破碎方法來進(jìn)行。為了分離旦白，也可以采用Auerbach和Rosenberg在歐州專利申請0140864中敘述的其他方法，其中包括采用溫度敏感的溶解細(xì)菌。如果多肽在細(xì)胞提取液中沉淀，加入變性劑可以使其重新溶解。這種技術(shù)是眾所周知的。有關(guān)方法已由Builder等在Ep-A-114，506，1984年8月1日出版，進(jìn)行了綜述。這里特作為例子的變異AAT分子，除了AATD15外，都可以溶在標(biāo)準(zhǔn)的大腸桿菌提取液中。

然后采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可以分離溶液中的變異AAT分子。例如這包括加入硫酸銨（60-80%飽和度），以選擇性地沉淀變異的AAT，然后再度溶解。含有變異AAT的溶液再進(jìn)行一系列層析步驟，例如采用DEAE（O-二乙胺基乙基）-纖維素、伴刀豆球旦白瓊脂糖凝膠、苯瓊脂糖凝膠、二硫化物結(jié)合配位體，反相高壓液相層析（HPLC）和采用抗-AAT抗體親和柱。這些方法已由Lathe等在自然（Nature）284：473-474（1980）中進(jìn)行了敘述。為了服用，在進(jìn)行藥用稀釋所需重新溶解前，可以將提純的變異AAT進(jìn)行冷凍干燥。

變異的AAT分子在大約PH5.5以下不穩(wěn)定。旦白質(zhì)在室溫下穩(wěn)定1-2天，在4℃，則可穩(wěn)定較長時間。為了保存提純的AAT，經(jīng)典上采用磷酸鈉緩沖液（PH8.0）。

更好的提純方法是一種取代層析，它包括將本發(fā)明的一種未提純的變異AAT旦白質(zhì)溶液同事先連結(jié)在一種不溶解載體間質(zhì)的Kappa（K）鏈相連結(jié)?？梢詤㈤哃aurell等歐州生物化學(xué)雜志（Eur.J.Biochem.）57：107-113（1975）;Laurell層析雜志（J.Chromat.）159：25-31（1978）;Laurell層析雜志，278：53-61（1983）。K鏈可以從患有骨髓瘤病人的尿中得到，采用已知技術(shù)，可以將其結(jié)合至適當(dāng)?shù)妮d體間質(zhì)上。載體間質(zhì)包括例如瓊脂糖、親合-凝膠、葡聚糖、纖維素、聚苯乙烯、聚丙酰胺、硅膠、尼龍、丙烯共聚物和聚酯等。

本發(fā)明的變異AAT可以用作旦白酶抑制劑，并可以治療AAT活性不足引起的肺氣腫。這種活性不足可以因AAT的氧化而引起，例如吸煙，或者是由于產(chǎn)生AAT的遺傳缺陷而造成的。例如Geolk等在美國呼吸疾病綜述（Am.Rev.Respir.Dis.）127：545（1983）一文中證實，AAT在治療AAT缺陷純合子的病人的非腸道補(bǔ)償治療中有用。關(guān)于變異AAT的其他用途包括抗體的產(chǎn)生，在層析提純多種旦白質(zhì)時作為結(jié)合劑，在含有混合物或溶液的旦白質(zhì)中抑制旦白酶。其他用途還包括治療胰腺炎、燒傷（見Schultze等美國專利3，293，236），以及用于生產(chǎn)AAT-缺陷病人血清診斷的抗體。這些應(yīng)用可以通過各自領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所掌握的技術(shù)來實現(xiàn)。

本發(fā)明變異的AAT具有AAT活性，而且在免疫學(xué)上與AAT緊密有關(guān)。因此可以以AAT相同的方式被利用。尤其是這種變異AAT可以按配方制造為了用于內(nèi)服，典型的是靜脈注射，采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將其溶于一種可作藥用的載體中。藥用載體是眾所周知的。這些適于作靜脈注射用的載體，例如包括氯化鈉溶液，醋酸鹽溶液，葡萄糖甘露糖醇以及清旦白溶液。變異的AAT也可以同生理上適用的賦形劑相結(jié)合，關(guān)于這方面Mitra在美國專利4，496，689中已有闡述。服用劑量及次數(shù)依疾病程度和性質(zhì)以及服用的特殊變異分子活性而變化。對于患AAT遺傳缺陷的病人，以維持血清AAT活性水平至少相當(dāng)于正常量35%來選擇服用劑量和次數(shù)。典型的是需要每周靜脈輸液具有可以與AAT可相比較活性的變異AAT1-15克，最好是2-10克。突變的分子由于在旦白質(zhì)其他部位例如在活性位點(diǎn)進(jìn)行突變，而顯示更加穩(wěn)定的活性的優(yōu)點(diǎn)，有可能服用較低劑量和較少次數(shù)。

下面對本發(fā)明的例子進(jìn)行了闡明，但不限于此。所有的限制性內(nèi)切酶都是市購得到的，并按照出售廠家說明來使用。

實施例

例1pOTsα1Bc1

人的ATT基因已從pULB1523互補(bǔ)DNA（cDNA）克隆中分離出來（A.Bollen.比利時專利895，961）基因是從包括整個cDNA克隆的PstⅠ片段中得到的。

PstⅠ片段被插入到pUC9單一的PstⅠ切點(diǎn)（從美國Bethesda研究實驗室，Gaithersburg，馬里蘭州。得到的一種pBR322載體，含有來自M13具有多個單一酶切位點(diǎn)的片段）。用限制性內(nèi)切酶SalⅠ酶切這個新的載體，結(jié)果在cDNA片段3′-末端PstⅠ切點(diǎn)下行10個堿基對處產(chǎn)生一個單一切口。用外切酶Bal31處理線性載體以除去AAT基因3′-末端后面的GC尾部。條件如下：總體積為200毫升，0.4毫摩爾濃度Cacl2，0.4毫摩爾濃度Mgcl2，40毫摩爾濃度Nacl，24毫摩爾濃度Tris（三羥甲基氨基甲烷）PH8，0.2毫摩爾濃度EDTA（乙二胺四乙酸）和40毫克DNA。反應(yīng)在30℃保溫進(jìn)行2分鐘加入20單位外切酶Bal31（從Betheda研究實驗室購得，Gaitherburg馬里蘭州）。每15秒從混合液中取25ml樣品，加入最終濃度為50毫摩爾濃度乙二胺四乙酸以終止反應(yīng)。按分鐘為時間單位分析DNA，結(jié)果表明GC尾部已從AAT基因3′-末端去掉，并在AAT終止密碼下行方向基因保留為40個堿基對。采用KlenowDNA多聚酶（Maniatis等，分子克?。簩嶒炇謨裕?982，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約）。DNA被補(bǔ)齊得到一個鈍末端分子，再插入一個協(xié)作實驗室提供的內(nèi)切酶XhoⅠ接頭（Maniatis等），從而組建了pUCα1-2。

用XhoⅠ和BclⅠ酶切pUCα1-2可以分離出AAT基因，BclⅠ切在AAT基因5′-末端起始密碼下行45堿基對處。用標(biāo)準(zhǔn)連接方法（Maniatis等）將基因插入用BamHⅠ和XhoⅠ酶切過的表達(dá)載體pOTSV上。結(jié)果構(gòu)成了一個pOTSα1BcL，這是一種本發(fā)明的載體。它包括除去基因成熟5′-末端前15個氨基酸外，整個AAT編碼的一種變異AAT基因。

將帶有轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，OOP終止區(qū)的189堿基對片段插入pAS1的BamHⅠ切點(diǎn)下方向NruⅠ位點(diǎn)，將一種合成的接頭（XbaⅠ，XhoⅠ，SaeⅠ）插至加入的終止區(qū)和BamHI位點(diǎn)之間，從而由pAS1衍生得到了pOTSV（Devare等，細(xì)胞（Cell）36：43-49（1984））。

采用標(biāo)準(zhǔn)步驟（Maniatis等）將pOTSα1BcL轉(zhuǎn)化至一種大腸桿菌溶原化的htpR165株（Cooper等，分子和普通遺傳學(xué)（Mol.Gen.Genet.）139：167（1975）;Baker等美國科學(xué)院院報（Proc.Natl.Acod.Sci.U.S.A.）81，6779（1984））和一種野生型CI+缺陷型K12溶原菌種中。在熱誘導(dǎo)（M.Rosenberg等，酶學(xué)方法（Meth.Enzym.）101：123（1983））或萘啶酮酸誘導(dǎo)之前（Mott等美國科學(xué)院學(xué)報82：88（1985）），轉(zhuǎn)化子生長至對數(shù)期。

誘導(dǎo)后，離心收集細(xì)胞，加入溶菌酶溶液溶菌（1克細(xì)胞/10毫升溶液，50毫克分子濃度三羥甲基氨基甲烷，0.1毫克分子濃度乙二胺四乙酸（EDTA），0.1毫克分子濃度二硫蘇糖醇（DTT），0.1%脫氧膽酸鹽（DOC）和0.5克/毫升溶菌酶）。用超聲波破碎（細(xì)胞）懸液，然后攪拌至少4小時。再進(jìn)行低速離心20分鐘（10，000轉(zhuǎn)/分）分離懸液。將細(xì)胞碎片再懸浮于已予先加入最終濃度為4克分子濃度尿素的三羥甲基氨基甲烷緩沖液。再用超聲波處理懸液，室溫下過夜攪拌。再通過低速離心20分鐘進(jìn)行分離。收集上清液，對緩沖液透析（50毫克分子濃度，三羥甲基氨基甲烷，PH8，25毫克分子濃度Nacl，1毫克分子濃度DTT）。兩將溶液上樣臺，一種DEAE（O-二乙胺基乙基）-Trisacryl柱上，用25-500毫克分子濃度Nacl進(jìn)行梯度洗脫。將洗脫峰部分溶液對緩沖液透析（50毫克分子濃度三羥甲基氨基甲烷，PH8，25毫克分子濃度Nacl）并測定旦白質(zhì)濃度以及抗-胰旦白酶和抗-彈性旦白酶活性。收集的150-250毫克分子濃度Nacl洗脫液部分含AATD15將近90%純度。

在進(jìn)行胰旦白酶和彈性旦白酶測定時，AATD15顯示人血清AAT（Sigma化學(xué)公司，Louis，Missouri）和酵母AAT（甲硫氨酸-門冬氨酸-脯氨酸）的10-15%活性?；钚缘慕档蛽?jù)信是由于使用了尿素。在另一種情況下，是由于在堿性條件下使用了硫氰酸緣故。按照Travis在酶學(xué)方法，80：755-765（1981）所述方法進(jìn)行胰旦白酶測定，100毫升胰旦白酶（15毫克），200毫升三羥甲基氨基甲烷（10毫克分子濃度，PH8）和200毫升AATD15（30毫克），在10毫克分子濃度磷酸鈉溶液（PH7.6）中組成的反應(yīng)混合液在室溫保溫15分鐘。然后加入2.5毫升底物（對-甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯，1.3毫克/毫升），緩沖液（10毫克分子濃度三羥甲基氨基甲烷，PH8）。在5分鐘內(nèi)，以253毫微米吸收值對每分鐘作圖。

測定彈性旦白酶也采用Travis步驟，將45毫克，N-琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酸-P-硝基酰苯胺（Sigma化學(xué)公司，Louis，MO）加到5毫升二甲基亞砜中制備底物貯存液（20毫克分子濃度）。加入0.3毫克豬胰彈性旦白酶（Sigma化學(xué)公司，Louis，MO）制備成酶溶液。向盛于水杯中的250毫升酶溶液加入0.2毫升緩沖液（200毫克分子濃度三羥甲基氨基甲烷-鹽酸PH8）。將等克分子量的AATD15加至溶液中，室溫下，將溶液保溫1分鐘。加入無離子水至最終體積為2，950毫升。然后加入50毫升底物溶液，混合溶液。觀察5分鐘內(nèi)在410毫微米的吸收值。

例2pHJα1-2

pMG27N（Gross等，分子細(xì)胞生物學(xué)（Mol.Cell.Biol）5：1015（1985））是pOTSV缺失了PL啟動子上行方向大約900堿基對的EcoRⅠ-BalⅠ片段，并造成載體上4個NdeⅠ切點(diǎn)缺失了3個而產(chǎn)生的。由pULB1523（BamHⅠ切于第一和第二密碼子間的編碼序列）中AAT編碼序列的BamHⅠ-XhoⅠ（末端補(bǔ)齊）片段插入到pMG27N的BamHⅠ和SalⅠ切點(diǎn)之間。操作步驟實際上按前引證的Maniatis等人方法進(jìn)行。這種pHJα1-1載體表達(dá)成熟天然AAT（第一個氨基酸，甲硫氨酸代替了甘氨酸）少于細(xì)胞總旦白的大約0.1-0.3%CIIATG下行方向的BamHⅠ切點(diǎn)依然保留。

用NdeⅠ和BclⅠ酶切pHJα1-1以缺失16個密碼中的2個。按表1所述，用一種合成的寡核苷酸接頭取代這一片段，以制備得到pHJα1-2。采用質(zhì)?！霉押塑账幔?∶50比例和標(biāo)準(zhǔn)連接步驟來插入片段?？捡R斯亮蘭染色的聚丙酰胺凝膠掃描可以確定，在用熱和萘啶酮酸誘導(dǎo)后，變異的AAT旦白，HJ2表達(dá)數(shù)量大約相當(dāng)于pHJα1-1AAT量的2倍。

例3pOTSα1-3

用BamHⅠ和XhoⅠ酶切pUCα1-2，可以分離出全部AAT基因。片段與BamHⅠ和XhoⅠ酶切的POTSV載體相連接得到POTSα1。POTSα1保存于美國菌種保藏中心，Rockville，Maryland，U.S.A，保藏號53282。然后用BamHⅠ和BclⅠ酶切這種新載體，這兩種酶從組成成熟旦白前15個氨基酸的AATN-末端切開了DNA片段。用編碼上面表1所敘15個氨基酸的合成DNA（即兩種重疊的寡核苷酸接頭）來取代這種片段。這種載體pOTSα1-3表達(dá)AAT的水平類似于pHJα1-2產(chǎn)生的變異AAT。

例4pSyn7

將原來AATcDNA克隆pULB1523的一段BamHⅠ-PstⅠ（末端補(bǔ)齊）片段插入到用BamHⅠ和SalⅠ（末端補(bǔ)齊）酶切過的pAS1中。插入的AAT片段在3′-末端含有GC尾部。用一種第三位密碼子發(fā)生變化引入3個密碼子的合成寡核苷酸接頭取代AAT基因5′-末端的一個BamHⅠ-Fnu4HⅠ片段。這樣構(gòu)建的足夠長度AAT編碼其中N-末端氨基酸序列如前表1所述是甲硫氨酸-門冬氨酸-脯氨酸。在分析DNA序列時，可以發(fā)現(xiàn)構(gòu)建過程中第7個密碼子缺失了。因此，除了第三個位置編碼變化外，這樣構(gòu)建的AAT缺失了氨基酸7。

用硫酸銨沉淀法提純Syn7旦白。離心收集轉(zhuǎn)化子，0℃，用含有0.5毫克/毫升溶菌酶和10毫克/毫升DNA水介酶的1/10體積TES緩沖液（50毫克分子濃度三羥甲基氨基甲烷，PH8，5毫克分子濃度乙二胺四乙酸和25%蔗糖）酶解30分鐘。加入Tritonx100最終濃度為0.1%，懸液于0℃保溫15分鐘，再加入1克分子濃度Mgcl2以使鎂離子濃度為80毫克分子濃度。懸液在25℃保溫5分鐘，15，000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘后收集上清液。將硫酸銨加至上清液中，溶液于10000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。在50-75%硫酸銨組分處可以發(fā)現(xiàn)Syn7旦白。再將沉淀溶于緩沖液中（50毫克分子濃度三羥甲基氨基甲烷，PH8，25毫克分子濃度Nacl），對同樣緩沖液進(jìn)行透析。將溶液上DEAE（O-乙二胺基乙基）-Trisacryl層析柱，用25-500毫克分子濃度Nacl緩沖液梯度洗脫，（50毫克分子濃度三羥甲基氨基甲烷，PH8），將每一組分對緩沖液透析（10毫克分子濃度磷酸鈉，150毫克分子濃度Nacl）按照例1所述方法測定旦白質(zhì)濃度，抗-胰旦白酶和抗-彈性旦白酶活性。在150-250毫克分子濃度Nacl部分可以發(fā)現(xiàn)Syn7，其純度低于25%。它具有和血清來源及酵母來源的AAT相同水平的抗彈性旦白酶和抗胰旦白酶的活性，構(gòu)建的Syn7產(chǎn)生約比pHJα1-1多7倍的旦白。

在個別的實驗中，采用Laurell等，層析雜志（J.Chromatog）278：53-61（1981）的步驟，可以使Syn7提純實際上達(dá)到95%以上。也可以參照Laurell等歐州生物化學(xué)雜志（Eur.J.Biochem）57：107-113（1975）和Laurell層析雜志159：25-31（1978）。采用Berggard等生物化學(xué)雜志（J.Biol.Chem.）244：4299-4307（1969）的方法從患骨髓瘤病人尿中分離得到單個的Kappa鏈結(jié)合到溴化氫瓊脂糖4B上（Pharmacia，Piscatway，NewJersey）。根據(jù)Laurell等在Eur.J.Biochem57：107-113（1975）所述的方法，從細(xì)胞裂解物中用硫酸銨沉淀部分提純的一種Syn7（50毫克分子濃度Tromethamine）的緩沖溶液可以由于加入最終濃度為20毫克分子濃度的β-巰基乙醇而減少。將溶液上樣于BiogelP30分子篩。然后溶液再通過K-鏈/瓊脂糖柱用加有1毫克/毫升二巰基二硝基苯甲酸和0.25毫克/毫升二硫蘇糖醇的修改過的同樣緩沖液洗脫。加入最終濃度為20毫克分子濃度的β-巰基乙醇并且透析或采用磷酸鈉緩沖液（10毫克分子濃度PH7.5，0.15克分子濃度Nacl）上BiogelP150分子篩都會減少洗脫物。

例5pSyn7R

按照上述例4構(gòu)建pSyn7R。序列分析證實這種構(gòu)建編碼了足夠長度的AAT。如表1所述，其N-末端氨基酸序列是甲硫氨酸-門冬氨酸-脯氨酸。pSyn7R的AAT表達(dá)與Syn7大致相同。

例6pHJα1-5和POTSα1-5

用NdeⅠ和BclⅠ酶切pHJα1-1，這個質(zhì)粒缺失了組成AATN-末端前15個氨基酸的一個片段。用一段編碼后5個氨基酸的合成DNA序列取代這一片段。最后構(gòu)成除去成熟基因5′-末端前十個氨基酸外整個AAT的編碼。旦白質(zhì)，例如這里提到的AATD10，按照前述例4方法進(jìn)行提純。結(jié)果表明，按例1所述測定胰旦白酶和彈性旦白酶活性為100%，比pHJα1-1AAT的表達(dá)高大約200-250倍。將這種載體的一段BglⅡ-XhoⅡ片段克隆至POTSα1的BglⅡ-XhoⅠ之間構(gòu)建成POTSα1-1。

例7pHJα1-6

已經(jīng)構(gòu)建得到表達(dá)AATD5的pHJα1-6，并按照前述例6所敘方法提純旦白質(zhì)。AATD5的量大約是pHJα1-1表達(dá)量的150-200倍。AATD5按照上述例4方法進(jìn)行胰旦白酶測定發(fā)現(xiàn)其活性為100%。和例6一樣，將一段BglⅡ-XhoⅠ片段插入pOTSα1以構(gòu)建得到pOTSα1-6。

例8pHJα1-4

如表1所示，按照例2敘述方法構(gòu)建pHJα1-4，顯示它產(chǎn)生HJ2相當(dāng)于總細(xì)胞旦白質(zhì)的0.5-1%。

例9pα1-A

pASK是一種由PL啟動子和包括有CII核糖核旦白體結(jié)合點(diǎn)在內(nèi)的大腸桿菌半乳糖激酶（galk）基因構(gòu)成的質(zhì)粒。將pAS1的CII核糖核旦白體結(jié)合區(qū)置于與galk編碼序列相鄰處，其中BamHⅠ接頭被插在ATG和galk編碼序列的第二個密碼子之間，從而構(gòu)成這種質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化大腸桿菌C600（CI857）得到的轉(zhuǎn)化子當(dāng)它長在一種含麥康凱半乳糖的指示平板上時，則會使轉(zhuǎn)化子周圍瓊脂變紅。

將天然AAT編碼序列的45個堿基對BamHⅠ-BaclⅠ片段插入BamHⅠ切點(diǎn)，得到一種AATN-末端和galk編碼序列的翻譯的融合。質(zhì)粒pAATgalk轉(zhuǎn)化至大腸桿菌C600（CI1857）不引起指示平板變?yōu)榧t色。Western印跡分析表明這種轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生雜交旦白質(zhì)，其數(shù)量相當(dāng)于用pASK轉(zhuǎn)化的細(xì)胞表達(dá)的galk量的大約0.3-0.5%。

為了得到突變株，在另一實驗中，在體外用羥胺處理pAATgalk，并且使pAATgalk通過一種名為mutT或mutD的突變細(xì)胞系。（見Miller分子遺傳學(xué)實驗）。用誘變處理過的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌C600，并涂布于指示平板上。分離得到若干個紅色菌落。用Western-吸印方法分析了AAT-galk雜交旦白質(zhì)的水平。與原來pAATgalk轉(zhuǎn)化子相比，一個“正突變”（up-mutant）變株，可以產(chǎn)生多10-20倍的雜交量。當(dāng)基因測定序列時發(fā)現(xiàn)，單點(diǎn)突變發(fā)生在第二個密碼子上，讀碼由GAT（門冬氨酸）變?yōu)锳AT（門冬酰胺）。

按例6所敘，將合成的寡核苷酸（見前表1）插入pHJα1-1，然后插入pOTSα1從而構(gòu)成了質(zhì)粒pα1-A。pα1-A轉(zhuǎn)化的大腸桿菌C600（CI857）產(chǎn)生的變異AAT相當(dāng)于pHJα1-1AAT數(shù)量的大約10倍。

例10pHJα1-7

將在pα1-A上含有單-核苷酸改變和pSyn7R三個核苷酸改變的一種合成寡核苷酸插入到pHJα1-1中，采用Western吸印分析檢測得到的變異AATHJ7的表達(dá)是Syn7的5-10倍，是由pHJα1-1所產(chǎn)生的30-50倍。

例11POTSα1-7

將穿過一部分5′-突變下行方向AAT編碼序列的變異的AAT編碼序列上行區(qū)所組成的pHJα1-7BstXⅠ片段插入pOTSα1的一個BstXⅠ片段中。在兩種載體中關(guān)于AAT基因位點(diǎn)在相同位置。將構(gòu)建得到的pOTSα1-7轉(zhuǎn)化至大腸桿菌AR120。誘導(dǎo)產(chǎn)生的HJ7表達(dá)數(shù)量相當(dāng)于總細(xì)胞旦白質(zhì)的15%，或比pHJα1-1表達(dá)AAT量約多150-200倍。

例12Pα1-AG

按照例9，將由存在于Pα1-A上單-核苷酸變化和第三個密碼子（脯氨酸）（見表1）的第三位上C變成G所組成的一種合成寡核苷酸插入到pOTSα1中。用Pα1-AG轉(zhuǎn)化的大腸桿菌（C600CI857）產(chǎn)生變異的AAT，HJ7，為pHJα1-1產(chǎn)生AAT量的20多倍。

例13Pα1-AGcro

表達(dá)載體pRDNS是以如下步驟構(gòu)建的：載體pMG27N（見例2）用AvaⅠ酶切，然后423堿基對AvaⅠ-XhoⅠ片段和774堿基對XhoⅠ-AvaⅠ片段，插入pOTS得到的載體pMG27N-S用BamHⅠ酶切，并同含有NS1基因（Young等，美國科學(xué)學(xué)院院報（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.）60：6105-6109（1983））的pAS1△EH801BamHⅠ片段相連接。載體pMG27N-SNS1，唯一的NdeⅠ切點(diǎn)處進(jìn)行酶切，用綠豆核酸酶進(jìn)行處理，并再連接。用SalⅠ和NcoⅠ酶切這個載體pMG27N-SNS1-MB。在這些酶切點(diǎn)間插入一段編碼突變的Cro核糖體旦白結(jié)合點(diǎn)（rbs）的合成寡核苷酸。引入這種rbs的突變（對于ATG來說，分別在2位和3位CA代替了TG）使得我們可以在ATG相鄰處引入單一的NdeⅠ和SalⅠ切點(diǎn)。Shine-Dalgarno序列和與ATG的距離與野生型Crorbs的相同。在PL和Cro核糖體旦白結(jié)合點(diǎn)控制下，野生型AAT序列從pHJα1-1移到pRDNS以安放編碼序列。同例11一樣，質(zhì)粒的一個BstXⅠ片段被插入POTSα1的BstXⅠ切點(diǎn)之間。得到的質(zhì)粒pRDNSα1-1AAT表達(dá)水平為質(zhì)粒pOTSα1-1的3倍，盡管這樣基因編碼序列沒有變化。

在PL和Cro核糖體旦白結(jié)合點(diǎn)控制下，來自Pα1-AG的變異AAT編碼序列被插至pRDNS，以放置編碼序列。如前所述，將一段BstX片段克隆至POTSα1。得到的質(zhì)粒是Pα1-AGCro。帶有這種質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生變異的AAT量比Pα1-AG轉(zhuǎn)化子多3倍，比pHJα1-1產(chǎn)生的AAT數(shù)量多60倍。

例14pα1-Acro

在PL和Cro核糖體旦白結(jié)合點(diǎn)控制下，pα1-A的變異AAT編碼序列被插至pRDNS，以插入編碼序列。用pOTSα1再一次施行BstXⅠ片段轉(zhuǎn)換。得到的質(zhì)粒是pα1-Acro。帶有這種質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生HJ7量為pα1-A轉(zhuǎn)化子的3倍。

以上所述及實例對本發(fā)明進(jìn)行了充分闡明并予以具體化。但本發(fā)明并不限于這里公開的各類精確的構(gòu)建，有關(guān)它們的各種修改和變化也包括在下述權(quán)利要求的范圍內(nèi)。

表二

編碼序列蛋白質(zhì)總細(xì)胞蛋白百分?jǐn)?shù)%

POTSα1AAT0.1-0.3

pHJα1-1AAT（0.1-0.3）

pHJα1-2HJ2（0.3-0.5）

pOTSα1-3AAT0.3-0.5

pSyn7Syn71-2（.3-.5）

pSyn7RAAT1-2（.3-.5）

pOTSα1BclAATD1520-30

pHJα1-4HJ2（0.5-1）

pHJα1-5AATD10（4-6）

pOTSα1-5AATD1013-18

pHJα1-6AATD5（3-5）

pOTSα1-6AATD510-15

pα1-AHJ71-2

pα1-AcroHJ73-5

pα1-AGHJ72-3

pα1-AGcroHJ75-10

pHJα1-7HJ7（3-5）

pOTSα1-7HJ710-15