本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種檢測snca基因dna甲基化水平的引物探針組合物及其應用。

背景技術：

1、帕金森病(pd)是一種常見的神經退行性疾病，主要病理特征為黑質多巴胺能神經元的丟失和路易小體的形成。路易小體的主要成分為異常聚集的α-突觸核蛋白(snca)，其異常表達與pd的發(fā)病機制密切相關。dna甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾方式，調控基因表達。snca基因的甲基化狀態(tài)與α-突觸核蛋白的異常表達之間存在密切關聯(lián)，且snca基因的甲基化水平在pd患者中表現出低甲基化趨勢，提示其可能作為pd輔助診斷的潛在生物標志物。

2、然而，目前關于snca基因甲基化pd中的研究多集中于小樣本隊列，缺乏多中心、大樣本的驗證，且其動態(tài)變化及與疾病進展的關系仍需進一步探索。

技術實現思路

1、為了彌補現有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測snca基因dna甲基化水平的引物探針組合物及其應用，進而評估snca基因dna甲基化水平在pd診斷中的應用價值。

2、為了實現上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

3、本發(fā)明第一方面提供一種引物探針組合物。

4、進一步，所述的引物的核苷酸序列包括seq?id?no.1-2、seq?id?no.4-5、seq?idno.7-8、seq?id?no.10-11中的一對或以上；所述的探針的核苷酸序列包括seq?id?no.3、seq?id?no.6、seq?id?no.9、seq?id?no.12中的一條或以上。

5、進一步，所述引物探針組合物包括seq?id?no.1-3組合、seq?id?no.4-6組合、seqid?no.7-9組合、seq?id?no.10-12組合中的一種或多種。

6、進一步，所述引物探針組合物中還含有針對內參基因檢測的引物和探針。

7、優(yōu)選地，所述內參基因包括但不限于gapdh、β-actin、b2m、actb、sdha、hprt1、arbp等。

8、本技術所述“內參基因”可以是各種持家基因(house-keeping?genes)，所述持家基因在細胞內組成穩(wěn)定性表達，有助于保持細胞的功能。持家基因在生物體各類細胞中都表達，其產物是對維持細胞基本生命活動所必需的蛋白質編碼的基因，如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因與核糖體蛋白基因等。

9、在本發(fā)明中，所述引物探針組合物用于檢測snca基因dna甲基化水平，所述snca基因定位于人染色體4q21-23上(nc_000004.12，89724099-89838324)，跨度大約121198bp，gene?id:6622，本研究區(qū)段位于基因第6704-7147bp之間，序列如下：

10、ggagcctaaggaaagagacttgacctggctttcgtcctgcttctgatattc

11、ccttctccacaagggctgagagattaggctgcttctccgggatccgctttt

12、ccccgggaaacgcgaggatgctccatggagcgtgagcatccaacttttctc

13、tcacataaaatctgtctgcccgctctcttggtttttctctgtaaagtaagca

14、agctgcgtttggcaaataatgaaatggaagtgcaaggaggccaagtcaac

15、aggtggtaacgggttaacaagtgctggcgcggggtccgctagggtggagg

16、ctgagaacgccccctcgggtggctggcgcggggttggagacggcccgcga

17、gtgtgagcggcgcctgctcagggtagatagctgagggcgggggtggatgt

18、tggatggattagaaccatcacacttgggcctgctgtttg(seq?id?no.13)。進一步，所述引物探針組合物的核苷酸序列包括如下成分：

19、(1)用于snca基因cpg島位置1甲基化水平檢測的引物探針組合：

20、seq?id?no.1：5’-gggggggagattaggttgttttttcg-3’；

21、seq?id?no.2：5’-ggacctccaccctaacgaaccccgcgc-3’；

22、seq?id?no.3：5’-ccctttcgggaaacgcgaggatgtttt-3’；

23、(2)用于snca基因cpg島位置2甲基化水平檢測的引物探針組合：

24、seq?id?no.4：5’-aggttgttttttcgggattcgttttttttc-3’；

25、seq?id?no.5：5’-ctttacaaaaaaaaaccaaaaaaacg-3’；

26、seq?id?no.6：5’-cgcgaggatgttttatgg-3’；

27、(3)用于snca基因cpg島位置3甲基化水平檢測的引物探針組合：

28、seq?id?no.7：5’-gggggggaggaggttaagttaataggtggtaac-3’；

29、seq?id?no.8：5’-cccgccctcaactatctaccctaaacaaacgccgc-3’；

30、seq?id?no.9：5’-ggtggtaacgggttaataagtgttggcgcggg-3’；

31、(4)用于snca基因cpg島位置4甲基化水平檢測的引物探針組合：

32、seq?id?no.10：5’-cgggtggttggcgcggggttggagac-3’；

33、seq?id?no.11：5’-aactcaaacaaacaacaaacccaaatataataa-3’；

34、seq?id?no.12：5’-gcggcgtttgtttagggtagatagttgaggg-3’。

35、進一步，所述位置1在snca基因6792bp處，所述位置2在snca基因6809bp處，所述位置3在snca基因6968bp處，所述位置4在snca基因7049bp處。

36、在本發(fā)明的各個方面中，所用的引物、探針不限于本發(fā)明所記載的具體序列，而是包括了與其具有至少80％，優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少99％同一性，并且仍然保持其功能的那些序列。本領域技術人員可以通過常規(guī)程序確定序列同一性。

37、在一些實施方案中，所述引物可使用標記物質標記。所述標記物質包括但不限于熒光物質、放射性同位素或酶。其中，熒光物質包括但不限于tamrattm、alexa555、alexa647、花青染料系列的cy3、cy5、熒光素。放射性同位素包括但不限于32p、33p、35s。酶包括但不限于堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶。

38、在一些實施方案中，所述探針的兩端，各自獨立地，設置有熒光標記集團和熒光淬滅集團。優(yōu)選地，所述不同序列的探針兩端的標記集團和淬滅集團可以相同或不同，優(yōu)選不同。

39、所述熒光標記基團各自獨立地選自fam、vic、hex、joe、cy3、rox和cy5中的一種。

40、所述熒光淬滅集團各自獨立地選自bhq1、bhq2、bhq3、tamra和mgb中的一種。

41、本發(fā)明第二方面提供一種試劑盒。

42、進一步，所述試劑盒包括本發(fā)明第一方面所述的引物探針組合物。

43、進一步，所述試劑盒還包括亞硫酸氫鹽修飾試劑、常規(guī)pcr擴增試劑。

44、進一步，所述常規(guī)pcr擴增試劑包括dntp、dna聚合酶、擴增緩沖液。

45、進一步，所述試劑盒還包括說明書。

46、在本發(fā)明中，適合量的一種或多種引物或探針被提供在一個或多個容器中，或固定在基質上，引物可以被提供成懸浮在水溶液中，或例如作為冷凍干燥的或凍干的粉末。其中，提供有核酸的容器可以是任何能夠容納所提供的形式的常規(guī)容器，例如微量離心管、安瓿瓶或瓶。

47、在某些應用中，一個或多個引物或探針(如上所述)，可以預先測量好的單次使用量提供在獨立的、典型情況下用后即可拋棄的管或相當的容器中。使用這樣的設置，用于測試snca基因dna甲基化存在的樣品，可以加入到獨立的管中，直接進行擴增。

48、在某些實施方案中，試劑盒可以含有執(zhí)行pcr擴增反應所必需的反應試劑，包括dna樣品制備試劑、用于pcr的酶、緩沖液、mg2+和脫氧核糖核苷酸(dntps)。

49、其中，pcr的酶包括dna聚合酶和/或rna聚合酶。

50、dntp是為了進行基于pcr的dna擴增的核苷源，datp、dgtp、dctp、dttp這4種是必要的。另外，關于dntp，可使用為了用于熱啟動法而進行了化學修飾的物質，例如可使用trilink?biotechnologies，inc.制cleanamptm?dntp。

51、優(yōu)選地，所述試劑盒中還可以包括陽性質控品、陰性質控品。具體地，所述陽性質控品為人甲基化標準品dna，陰性質控品為人非甲基化標準品dna。

52、在本發(fā)明中，所述“亞硫酸氫鹽修飾試劑”是指在一些實施方案中包含亞硫酸氫鹽(bisulfite)、亞硫酸氫鹽(disulfite)、亞硫酸氫鹽(hydrogen?sulfite)或其組合的試劑，經過亞硫酸氫鹽試劑處理的dna，其未經過甲基化的胞嘧啶核苷酸將轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶及其他堿基維持不變，因此可以區(qū)分例如cpg二核苷酸序列中的甲基化和未甲基化胞苷。

53、優(yōu)選地，所述試劑盒中還可以包括dna純化試劑、dna提取試劑等。具體地，所述dna提取試劑可包括裂解緩沖液、結合緩沖液、清洗緩沖液和洗脫緩沖液。裂解緩沖液通常由蛋白變性劑、去垢劑、ph緩沖劑和核酸酶抑制劑組成。

54、更優(yōu)選地，所述試劑盒中還可以包括用于標明檢測操作步驟和結果判定標準的說明書。

55、在其中一些實施例中，所述試劑盒可以用于以下檢測平臺：pcr擴增法、熒光定量pcr法、數字pcr法、液相芯片法、三代測序法、二代測序法、焦磷酸測序法、重亞硫酸鹽轉化測序法、甲基化芯片法、簡化亞硫酸氫鹽測序技術或它們的組合。

56、實施本發(fā)明時，作為另外的必要的器具，可舉出移液器、移液器用槍頭、1.5ml微型管(microtube)等在分子生物學的實驗中廣泛使用的器具類，作為裝置類，可舉出pcr、凈化臺、管用離心機等在分子生物學的實驗中廣泛使用的儀器。

57、本發(fā)明第三方面提供一種檢測snca基因dna甲基化水平的方法。

58、進一步，所述方法包括采用本發(fā)明第一方面所述的引物探針組合物對樣本dna進行pcr擴增。

59、進一步，所述樣本dna為亞硫酸鹽處理后的人類基因組dna。

60、優(yōu)選地，所述人類基因組dna從人類全血樣本中獲得。

61、優(yōu)選地，所述pcr擴增在相似的擴增條件下進行。

62、優(yōu)選地，所述pcr擴增的體系包括：以總體積25μl計，所述pcr擴增的體系包括：2×pcr反應緩沖液12.5μl、上下游引物各1μl、探針1μl，樣本dna?5μl，余量為水。

63、優(yōu)選地，所述pcr擴增的反應條件為：

64、1)95℃預變性30秒；

65、2)95℃變性20秒，49～52℃退火20秒，72℃延伸30秒，10個循環(huán)；

66、3)95℃變性5秒，53℃退火30秒，35個循環(huán)。

67、進一步，當使用seq?id?no.1-3組合進行pcr擴增時，其退火溫度為51℃；

68、優(yōu)選地，當使用seq?id?no.4-6組合進行pcr擴增時，其退火溫度為49℃；

69、優(yōu)選地，當使用seq?id?no.7-9組合進行pcr擴增時，其退火溫度為50℃；

70、優(yōu)選地，當使用seq?id?no.4-6組合進行pcr擴增時，其退火溫度為52℃。

71、本發(fā)明實施例部分提供了擴增條件的示例性實施方案。然而，在此所使用的術語“擴增條件”涉及適合于獲得靶的可檢測量的溫度和/或孵育時間。因此，術語“相似的擴增條件”意指若是期望，可以對各靶在相似的溫度下進行化驗。術語“相似的擴增條件”還指若是期望，可以對各靶在相似的孵育時間下進行化驗。在一些情況下，術語“相似的擴增條件”還涉及擴增循環(huán)的次數。然而，本領域內熟知，循環(huán)的次數并不總是嚴格的。例如，一些樣品可以在其他樣品之前被移除或被留下進行附加擴增循環(huán)。在其他情況下，術語“相似的擴增條件”還涉及所使用的緩沖液和擴增試劑(酶、核苷酸、鹽等)的性質。術語“相似的擴增條件”還指條件(例如,時間、緩沖液、循環(huán)次數、溫度等)可以稍微改變或可以相同。

72、本發(fā)明第四方面提供本發(fā)明第一方面所述的引物探針組合物在制備用于檢測snca基因dna甲基化水平的產品中的應用。

73、本發(fā)明第五方面提供本發(fā)明第一方面所述的引物探針組合物在制備用于診斷帕金森病的產品中的應用。

74、相對于現有技術，本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：

75、本研究采用基于qpcr平臺的snca基因甲基化檢測方法，相較于焦磷酸測序，不僅在成本上更為經濟，而且操作流程簡單快速、自動化程度高，能夠顯著縮短分析時間，適合大規(guī)模篩查和臨床應用。同時，qpcr具有較高的靈敏度和特異性，能夠精確檢測低豐度的甲基化dna，數據分析也更為簡便。此外，新設計的引物和探針針對snca基因啟動子區(qū)域中與帕金森病(pd)相關的特定甲基化位點，具有更高的特異性和準確性，能夠有效避免非特異性干擾，顯著提高了檢測的靈敏度和重復性。相比之前的結果，新引物探針在檢測低甲基化樣本時表現更優(yōu)，能夠為pd的輔助診斷提供更可靠的生物標志物，具有更高的臨床應用價值。

76、現有專利針對snca甲基化水平檢測的方法中只是展示了單個位點甲基化和非甲基化的擴增曲線，并未應用實際的臨床樣本進行正常人群和帕金森病人群的甲基化檢測，對于真實樣本的區(qū)分度以及檢測效果不明確。而且，按專利中的計算公式進行結果比較，理論上雖然可行，但僅通過擴增的ct值進行計算，存在精度度和重復性差的問題，對于后期臨床端的真實場景應用，會出現測試結果不穩(wěn)定，容易出現偏差。

77、我們是通過內參和甲基化位點的質粒分別對內參和甲基化位點進行擴增，建立各自的標準曲線，然后通過標曲計算各自的拷貝數，從而計算甲基化比例，這種方式得到的結果更加準確，穩(wěn)定性更好。

78、現有文獻應用焦磷酸測序的方式進行幾個位點的甲基化檢測，通過臨床樣本測試，診斷效能不高。

79、我們通過熒光定量pcr的方法，設計每個位點特異性的引物探針，對臨床樣本進行測試，結果顯示，能非常好的區(qū)分正常和pd病人樣本，具有很高的診斷靈敏度和特異性。