本發(fā)明總的說來是關(guān)于造血生長因子和編碼這些因子的多聚核苷酸。本項申請?zhí)貏e關(guān)系到哺乳類動物多潛能集落刺激因子，尤其是人的多潛能粒細胞集落刺激因子（hpG-CSF）、片斷及其多肽類似物以及編碼這些物質(zhì)的多聚核苷酸。
人類造血系統(tǒng)補充各種白細胞（包括中性白細胞，巨噬細胞，和嗜堿細胞/肥大細胞），紅細胞（紅血球）和凝血細胞（巨核細胞/血小板）。普通男性的造血系統(tǒng)估計每年可產(chǎn)生大約4.5×1011個粒細胞和紅細胞，相當于總體重的年替換量。Dexter等，BioEssays，2，154-158（1985）。
一般認為少量的某些造血生長因子使少數(shù)的前體“干細胞”分化成各種血細胞系，使這些系的大量增殖，并使這些系最后分化為成熟血細胞。由于造血生長因子是以極少量存在的，所以對這些因子的檢測和鑒定依賴于一系列分析，這些分析僅是在人工條件下，根據(jù)對培養(yǎng)細胞的刺激效應，來區(qū)別不同的因子。結(jié)果杜撰出一大堆名稱來指明為數(shù)少得多的因子，因而造成混亂，例如，如名稱IL-3，BPA，多-CSF，HCGF，MCGF和PSF全都是acronyms，現(xiàn)在認為都是用來表示一種鼠的單一造血生長因子。Metcalt，Slienle，229，16-22（1985），關(guān)于各種鼠的生長調(diào)節(jié)糖蛋白還可參見Burgess，etal。J.Biol.Chem.，252，1988（1977），Das，etal.Blood，58，600（1980），Thle，etal.，J.Zmmunol.，129，2431（1982），Nicola，etal.，J.Biol.Chem.，258，9017（1983），Metcalf，etal.，Int.J.Canler，30，773（1982），和Burgess，etal.Int.J.Cancer，26，647（1980）。
應用遺傳學重組技術(shù)使得這種混亂得到某種澄清。例如已經(jīng)得到了人紅細胞生成素的氨基酸和DNA序列它能刺激紅細胞的生成（見，Lin，PCTPublishedApplicationNo.85/02610，publishedJune20，1985）重組方法還可應用于人類粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的eDNA分離。參見Lee，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.（USA），82，4360-4364（1985）和Wong，etal.Slienle，228，810-814（1985）。關(guān)于鼠基因的克隆還可參見Yokota，etal.Prol.Natl.Acad.Sci.（USA），81，1070（1984），F(xiàn)ung，etal.，Nature，307，233（1984），和Gough，etal.，Nature，309，763（1984），而關(guān)于人的M-CSF可參見KawasaRi，etal.，Slieule，230，291（1985）。
人的造血生長因子，稱做人的多潛能集落刺激因子（hpCSF）或叫phripoietin，（造血素？）已經(jīng)證實存在于稱作5637的人膀胱癌細胞系的培養(yǎng)基中，并在特定的條件下用美國型培養(yǎng)收集器保存，Rockville，Marylanol作為A、T、C、C、保存號NO.HTB-9已報導在用人骨髓的祖細胞的實驗中。由這種細胞系中提純的hplSF能刺激多潛能祖細胞的增殖和分化，從而形成各種主要的血細胞。Welte等，Proc.Natl.Acaol.Sci（USA），82，1526-1530（1985）。所用的hpCSF的純化方法：（NH4）2SO4沉淀;陰離子交換層析（DEAE纖維素，DE52）;凝膠過濾（AcA54柱）;和C18反相高效液相層析法。鑒定為hpCSF的蛋白質(zhì)，它是在C18反相HPLC（HPLC-即高效液相層析的縮寫）洗脫部分的二個活性峰中的第二峰中被洗脫出來的，用十二烷基磺酸鈉（SDS）-聚丙酰胺凝膠電泳（PAGE），用銀染色法測定的。已報告它具有的早期報告hpCSF有一個等電點為5.5〔Welte，atal.，J.Cell.Biochem.，Supp9A，116（1985）〕，對小鼠粒白血病細胞系WEHI-3BD+有很高的分化活性〔Welte，etal.，UCLASymposiaonMolecular和CellwlarBiology，Gale，etal.，eds.，NewSeries，28（1985）〕。初步的研究表明，鑒定為hpCSF的因子，當在對人CFU-GM試驗中的頭七天時具有突出的粒細胞集落-刺激活性。
另一個叫做人CSF-β的因子，也已從人膀胱癌細胞系5637中分離出來，并已作為鼠的125Ⅰ標記的粒細胞集落-刺激因子（G-CSF）結(jié)合WEHI-3BD+細胞的競爭劑，與未標記的鼠G-CSF有相同的劑量-反應關(guān)系〔Nicola，etal.，Nature，314，625-628（1985）〕。以前曾報告這種劑量-反應關(guān)系是未標記的鼠G-CSF所特有的，而如M-CSF，GM-CSF，或多-CSF等因子并不具有這種關(guān)系?！睳icola，etal.，Proc.Natl.Acad，Sci.（USA），81，3765-3769（1984）〕。CSF-β和G-CSF在CSF因子中也是獨特的，它們誘導WEHI-3BD+細胞分化的能力都很高。Nicola，etal.，lmmnnologyToday，5，76-80（1984）。在高濃度時，G-CSF刺激混合的粒細胞/巨噬細胞集落形成細胞〔Nicola，etal.，（1984）supra〕.，hpCSF與人骨髓一起培養(yǎng)14天后出現(xiàn)粒細胞、單核白細胞、混合的粒細胞/單核細胞以及嗜酸細胞集落這一初步結(jié)果與上述觀點相吻合。還介紹了CSF-β在用小鼠骨髓細胞的試驗中能刺激中性白細胞和粒細胞集落的形成，對鑒定象G-CSF這樣的因子此特性已成為標準?；谶@些共同點，已用G-CSF（粒細胞集落刺激因子）鑒定人類CSF-β。Nicolaetal.，Nature，314，625-628（1985）。
基于他們的共同特性，看來Nicola等“supra”的人CSF-β和Welte等（supra）的hpCSF是同一種因子，恰可歸之為人的多潛能粒細胞集落刺激因子（hpG-CSF）。鑒于已報導過的鼠的G-CSF在“相當正常濃度”時，完全抑制體外WEHI3BD+白血病細胞群的能力和鼠G-CSF粗制注射劑抑制鼠的移植髓樣白血病的能力，hpG-CSF特征的確定和重組生產(chǎn)將是特別需要的。
參見Metcalf，Slience，229，16-22（1985）。也可見Sachs，ScientificAmerican，284（1），40-47（1986）。
可以證明hpG-CSF在治療上是有效的，因此需要有商業(yè)規(guī)模的用量，從細胞培養(yǎng)物中分離的方法不大可能提供一合適的材料來源。例如，值得注意的是人腫瘤細胞庫在商業(yè)上使用就會出現(xiàn)局限性，就象，人膀胱癌細胞系5637（A.T.C.C.HTB9），它已被報告用做天然的hpCSF分離物的來源，Welte，etal（1985，supra）。
根據(jù)本發(fā)明，提供了編碼全部或部分hpG-CSF的DNA序列。這些序列可包括：用選定的非哺乳類動物的宿主，摻入表達“優(yōu)選的”密碼子;提供限制性核酸內(nèi)切酶切割位點;提供附加的起始的、終止的或中間的DNA序列，這些序列便于構(gòu)建易表達的載體。本發(fā)明還提供了為hpG-CSF的多肽類似物或衍生物的微生物表達編碼的DNA序列，這些物質(zhì)在一種或多種氨基酸殘基的特性和定位上區(qū)別于天然存在的形式（即含有少于hpG-CSF所特有的全部殘基的缺失類似物;取代類似物，譬如〔Ser17〕hpG-CSF，其中特有的一個或多個殘基被別的殘基取代;和其它的類似物，其中在多肽的末端或中間部分加一個或多個氨基酸殘基），而它們具有天然存在型的某些或全部特性。
本發(fā)明中新的DNA序列包括：在原核的或真核的宿主細胞中用于安全表達多肽產(chǎn)物的序列，這些多肽產(chǎn)物至少具有天然存在的多潛能粒細胞集刺激因子中的部分一級結(jié)構(gòu)的構(gòu)型和一種或多種生物學特性。本發(fā)明的DNA序列可特別看出包括：（a）陳述在表Ⅶ和表Ⅷ中的DNA序列或是他們的互補鏈;（b）一種DNA序列，它能與另一些DNA序列（見表Ⅶ）或片段雜交（在如同此處所說明的雜交條件下或在更嚴格的雜交條件下）（c）一種DNA序列，如果沒有遺傳密碼簡并，它會雜交到表Ⅶ的DNA序列上。在（b）部分中特別包括一個基因組DNA序列，能編碼hpG-CSF的等位變異型和/或能編碼其他種屬哺乳類動物的多潛能粒細胞集落刺激因子。在（c）部分特別包括一個人工的DNA序列，它能編碼hpG-CSF、hpG-CSF片段和hpG-CSF類似物;這些DNA序列可摻入便于mRNA在微生物宿主中翻譯的密碼子。按照Alton等的方法（pCTpublishedapplicationWO83/04053）。可很容易地制備這些人工DNA序列。
本發(fā)明還包括一類多肽，它能被部分DNA體編碼到頂束人的cDNA上或基因組DNA序列（見表Ⅶ和Ⅷ）上，即“互補倒轉(zhuǎn)蛋白”如Tramontuno等所述，NucleicAcidsRes.，12，5049-5059（1984）。
本發(fā)明提供純化和分離的多肽產(chǎn)物，產(chǎn)物具有天然存在的hpG-CSF（包括其等位變異體）的部分或全部的一級結(jié)構(gòu)構(gòu)型（即氨基酸殘基的連續(xù)序列），和一種或多種生物學特性（例如：免疫特性和體外生物學活性），和物理特性（例如分子量）。這些多肽也可通過下列產(chǎn)物定性;化學金合成的產(chǎn)物;由基因組成CDNA克隆，或基因合成得到的外源性DNA序列的原核或真核生物宿主表達（例如：用細菌，酵母，高等植物，昆蟲，培養(yǎng)的哺乳動物細胞等）的產(chǎn)物。
典型酵母（例如Sallapomycescerevisiae）或原核〔例如：Escherichiacoli（E.coli）〕宿主細胞的產(chǎn)物是不與任何哺乳類動物的蛋白質(zhì)結(jié)合的。在脊椎動物（例如除人外的哺乳類動物和鳥類）細胞中的微生物表達的產(chǎn)物也不與任何人類蛋白結(jié)合。根據(jù)所使用的宿主，本發(fā)明的各種多肽可以同哺乳類動物的糖或其它真核生物的糖類發(fā)生糖基化作用，也可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括一種起始的甲硫氨酸殘基（在-1位上）。
本發(fā)明還包括藥物成分，它含有有效量的本發(fā)明的多肽產(chǎn)物，并配有適量的稀釋劑、輔料和/或hpG-CSF用于治療的載體。
本發(fā)明的多肽產(chǎn)品可以通過結(jié)合可探測的標志物（例如用125Ⅰ作放射標記）。標記，以提供一試劑，用于在固體組織和液體樣品（例如，血或尿）中對人類hpG-CSF檢測和定量。本發(fā)明的DNA產(chǎn)品也可用可探測的標志物、標記（例如放射標記和非同位素標記，如生物素標記），產(chǎn)品還可用在DNA雜交過程，以確定人類hpG-CSF基因定位和/或在染色體圖譜中的任何有關(guān)基因簇的定位。這些產(chǎn)品還可用來在DNA水平上鑒定人類hpG-CSF基因異常，以及用作基因標志物來鑒定鄰近基因及其異常。
本發(fā)明的多肽產(chǎn)品可以單獨使用，也可與其它造血因子或與治療造血異常（例如再生障礙性貧血）的藥物聯(lián)合使用。這些產(chǎn)品還可用于治療由于化療或放療而引起的造血細胞不足。舉例來說，骨髓移植的成功可能由于應用hpG-CSF而加強。醫(yī)治燒傷和治療細菌感染也可能由于應用hpG-CSF收益。此外，基于hpG-CSF分化白血病細胞的能力，可用于白血病的治療。Welte，etal.，Proc.Natl.Acaol.Sci（VSA），821526-1530（1985）和Sachs，（見前）。
根據(jù)以下詳細描述本發(fā)明的許多方面和眾多優(yōu)點對于工藝熟練者將是明顯的，這些描述提供了在目前更為具體地實施本發(fā)明的說明。
附圖是hpG-CSF基因的部分限制性核酸內(nèi)切酶圖，并用箭頭符號畫出為得到基因組序列所用的測序方案。
根據(jù)本發(fā)明，對于部分或全部hpG-CSF多肽序列進行編碼的DNA序列已被分離出來并做了定性。
列出的以下實例是為了解釋本發(fā)明，并特別指導在hpG-CSFcDNA和基因組克隆的鑒定之前所實行的操作步驟，進行這種鑒定的步驟，以及定序列的步驟，根據(jù)cDNA、基因組和人工基因建立表達系統(tǒng)并證實在這種系統(tǒng)中表達hpG-CSF產(chǎn)品和類似物產(chǎn)品。
尤其，例1是指導hpG-CSF的氨基酸確定序列的。例2是指導為菌落雜交篩選而制備cDNA庫。例3是關(guān)于雜交探針的構(gòu)建。例4是關(guān)于雜交篩選，陽性克隆的鑒定，陽性cDNA克隆的DNA定序以及多肽一級結(jié)構(gòu)構(gòu)型（氨基酸序列）信息的產(chǎn)生。例5是指導編碼hpG-CSF的基因組克隆的鑒定和序列分析。例6是指導建造編碼hpG-CSF的人工基因，其中使用了E.coli優(yōu)選的密碼子。
例7是指導為構(gòu)建摻入hpG-CSF-編碼DNA的E.coli轉(zhuǎn)化載體的步驟，在hpG-CSF的原核生物的表達中使用運載體，以及本發(fā)明的重組產(chǎn)品的特性分析。例8是指導生產(chǎn)hpG-CSF類似物的程序，其中半胱氨酸殘基通過編碼hpG-CSF的DNA誘發(fā)突變被其它合適的氨基酸所替換。例9是指導構(gòu)建一種摻入由陽性cDNA克隆產(chǎn)生的hpG-CSF類似物-編碼DNA的運載體，使用這種運載體轉(zhuǎn)染COS-1細胞，以及培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細胞生長的程序。例10是關(guān)于本發(fā)明重組多肽產(chǎn)物的物理學的和生物學的特性。
實例1
（A）用文獻方法提供的材料的定序
hpG-CSF樣品（3-4微克，85-90%純的SDS，銀染料-PAGE）是從紐約SloamKettering研究所得到的，是按照Welte等人的方法〔Proc.Natl.Acaol.Sci.（USA），82，1526-1530（1985）〕分離和純化的。
用AB407A型氣相序列儀（AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，Calitornia）用微量序列分析方法在運行＃Ⅰ中測定了這種hpG-CSF樣品的N-末端的氨基酸序列下面的表Ⅰ列出所得序列資料。在表Ⅰ至表Ⅳ中使用的是單字母的字符“X”是指不能明確測定的殘基，括弧內(nèi)的殘基僅是可更換的或是暫定的。
表Ⅰ
151015
K-P-L-G-P-A-S-K-L-K-Q-（G.V.S）-G-L-X-X-X
在每一個運行循環(huán)里都出現(xiàn)有高的本底，對此結(jié)果已列于在表1中，這表明樣品含有許多污染的成份，可能是由純化過程產(chǎn)生的化學殘基形式的雜質(zhì)。保留此序列僅作為參考用。
在運行＃2中，第二個樣品（5～6微克，約95%純度）如在運行＃1中一樣是得自Sloankettering，定序列的操作步驟也如同運行＃1中所使用的。本樣品與Welte等〔Proc.Natl.Acad.Sci（USA）82，1528-1530（1985）〕的圖4使用的材料是同一批。結(jié)果列于表Ⅱ。
表Ⅱ
盡管鑒定出了較多個殘基，但運行＃2并設(shè)有提供足夠的長和明確的序列，由此序列可以制造相當數(shù)量的探針，用來研究hpG-CSFDNA。已計算過若想根據(jù)表Ⅱ的序列分出cDNA，則至少需要1536枚探針。再有，樣品的污染是個問題。
據(jù)此，第三個樣品（3～5微克，～40%純）同上面一樣是得自SloamKettering。這個制劑當用SDS-PAGE分離以后又做了電印跡（electroblot），以進一步純化。此樣品的序列分析沒有得到數(shù)據(jù)。
（B）用修正方法提供的材料的定序
為了得到足夠量的純物質(zhì)以進行合適的確定氨基酸序列的分析，從E.Platzer博士處得到如在Sloam-Kettering所生產(chǎn)的。膀胱癌細胞系5637（亞克隆1A6）的細胞。將細胞放在燒瓶中，最初用Lscove′s培養(yǎng)基（GIBCO，GrandIsland，NewYork）培養(yǎng)使細胞融合。當融合后，將培養(yǎng)物用胰酶消化并接種到滾動瓶中（1～1/2燒瓶/瓶），每瓶含25毫升預先在5%CO2下處理過的Zscove培養(yǎng)基。在37℃和0.3rpm條件下細胞生長過夜。
用以下步驟將Cytodex-1珠（Pharmacia，leppsala，瑞典）進行洗滌和滅菌。將8克珠子裝入瓶中，再加入400毫升PBS。緩慢渦旋3小時，將珠懸浮起來。讓珠沉降下來以后，倒出PBS，將珠子用PBS漂洗，再加入新鮮的PBS。將珠子用高壓鍋消毒15分鐘。使用之前，將珠子再放在Islove培養(yǎng)基加10%胎牛血清（FCS）中洗滌，然后再加入新鮮的培養(yǎng)基加10%FCS以便得到處理過的珠子。
使每一個滾動瓶中保留30毫升的培養(yǎng)基，其余的都倒出，再向每個瓶中加入30毫升新鮮的培養(yǎng)基，加10%FCS和40毫升處理過的珠子。將5%CO2氣通入瓶中，并用抽氣法除去所有的氣泡，將瓶子放在滾動架上以每分鐘3轉(zhuǎn)的速率滾動半小時，然后再把速度降到每分鐘0.3轉(zhuǎn)。3小時后，將另一瓶進行胰酶消化并加入到每一個內(nèi)含珠子的滾動瓶中。
當40%到50%融合時，用50毫升PBS洗滌滾動瓶中的培養(yǎng)物，渦旋10分鐘，再除去PBS。將細胞放在培養(yǎng)基A〔Lscove培養(yǎng)基，內(nèi)含0.2%FCS，10-8摩爾氫化可的松，2毫摩爾谷酰胺，100單位/毫升青霉素，和100微克/毫升鏈霉素〕中培養(yǎng)48小時。然后，在3000rpm下離心15分鐘，收集培養(yǎng)物的上清液，在-70℃貯存。培養(yǎng)物再用內(nèi)含10%FCS的培養(yǎng)基A孵育，并培養(yǎng)48小時。當除去培養(yǎng)基之后，如前用PBS洗滌細胞并放入培養(yǎng)基A中培養(yǎng)48小時。再收集上清液并用以前所介紹的方法處理。
將大約30升用1A6細胞處理過的培養(yǎng)基濃縮至約2升，使用微孔薄膜，配有2塊分子量為10，000的Cutoffs，濾速約為200毫升/分。保留速率約為1000毫升/分。使用同樣的儀器和同樣的流速。用約10升50毫摩爾Tris（PH7.8）將濃縮液進行透析過濾。將經(jīng)過透析過濾的濃縮液以40毫升/分速度加到1升的DE纖維素柱上，柱已在50毫摩爾Tris（PH7.8）中平衡。上樣后，將柱子用1升50毫摩爾的Tris（PH7.8）以同樣的流速沖洗，再用2升帶有50毫摩爾Nall的50毫摩爾的Tris（PH7.8）沖洗。然后將柱子用六份1升的50毫摩爾Tris（PH7.5）溶液順序洗脫，這些溶液中分別含有以下濃度的NaCl：75mM;100mM;125mM;150mM;200mM;和300mM。收集各部分洗脫液（各50毫升）。合并活性部分并在Amicom超濾攪拌池裝置（配有YM5的膜）上濃縮至65毫升。把此濃縮液加到2升AcA54預先用PBS平衡凝膠過濾柱上。以80毫升/小時速率過柱，以每份10毫升進行收集。合并活性部分并直接加到C4的高性能液相色譜（HPLC）柱上。
樣品的體積范圍從125毫升至850毫升，內(nèi)含1～8毫克蛋白質(zhì)，樣品中約有10%的hpG-CSF，將此樣品上柱，流速范圍為每分鐘從1毫升至4毫升。上樣后，用0.1摩爾醋酸銨（PH6.0-7.0）在80%2-丙醇中的溶液開始沖洗，流速為1毫升/分。以每份1毫升收集，并分別在220nm，260nm和280nm處檢測蛋白質(zhì)。
純制結(jié)果，含hpG-CSF的部分已被徹底與其它含蛋白的部分分開（80份中的第72和73部分）分離出的hpG-CSF（150～300微克）純度約為85±5%，產(chǎn)率約為50%。在運行＃4中使用了這種純化了的物質(zhì)9μg，在做氨基酸序列分析時將蛋白質(zhì)樣品加到TFA-活化的，沒有polybrene的玻璃纖維圓盤上。用AB470A序列儀做序列分析，方法按照Hewick，etal.，J.Biol.chem.，256，7990-7997（1981）和Lai，Anal.ChimActa，163，243-248（1984）。運行＃4的結(jié)果見表Ⅲ。
表Ⅲ
1510
Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser-Leu-Pro-
1520
Gln-Ser-Phe-Leu-Leu-Lys-（Lys）-Leu-（Glu）-Glu-
2530
Val-Arg-Lys-Ile-（Gln）-Gly-Val-Gly-Ala-Ala-
Leu-X-X-
在運行＃4中，超出31的循環(huán)（相當于表Ⅲ中殘基31）沒有得到更明顯的序列信息。為了得到一個更長的明確的序列，在運行＃5中，將14微克由處理過的培養(yǎng)基中純化的hpG-CSF用10微升β-巰基乙醇在45℃的條件下還原一個小時，然后真空下徹底干燥。然后將蛋白質(zhì)殘渣再溶解于5%甲酸中，再加到polybrenized玻璃纖維圓盤上。用上面運行＃4同樣的方法做序列分析。運行＃5的結(jié)果見表Ⅳ。
表Ⅳ
1510
Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser-Leu-Pro-
1520
Gln-Ser-Phe-Leu-Leu-Lys-Cys-Leu-Glu-Gln-
2530
Val-Arg-Lys-Ile-Gln-Gly-Asp-Gly-Ala-Ala-
3540
Leu-Gln-Phe-Lys-Leu-Gly-Ala-Thr-Tyr-Lys-
45
Val-Phe-Ser-Thr-（Arg）-（Phe）-（Met）-X-
對于infra中所述制備hpG-CSFCDNA所需探針的建立來說，表Ⅳ中的氨基酸序列是足夠長（44個殘基）和肯定的。
例2
在分離CDNA的有意義序列標準步驟中，制備一個質(zhì)粒CDNA庫，此庫來自于根據(jù)靶基因表達而篩選的供體細胞中大量存在的反轉(zhuǎn)錄mRNA。此處多肽氨基酸序列的重要部分是已知的，標記的單鏈DNA探針序列與被認為存在于“靶”cDNA上的序列配對可以用于DNA/DNA雜交過程，此過程是在已變性成單鏈形式的cDNA的克隆拷貝上進行的。Weissmom，etal.，U.S.PatantNO.4，394，443;Wallace，etat.，NucleicAcidsRes.，6，3543-3557（1979），和Reyes，etal.，Proc.Natl.Acad.sci.（USA），79，3270-3274（1982），和Jaye，etal.，NucleicAcidsRes.，11，2325-2335（1983）。關(guān)于用作診斷的DNA/DNA雜交過程還可參見Falkow等人的U.S.專利NO.4，358，535。關(guān)于集落和噬菌斑雜交技術(shù)可參見Davis等人的“遺傳工程手冊，細菌遺傳學進展”，ColdSpringHarbor實驗室，ColdSpringHarbor，N.Y.（1980）pp.55-58和174-176。
總RNA是從大約1克的膀胱癌細胞系5637（1A6）的細胞中抽提出來的，為了定量的分離完整的RNA采用了硫氰胍方法〔Chirgwin，etal.，Biochemistry，18，5294-5299（1979）〕。
無菌RNA水溶液含有從1A6細胞中制得的總RNA。為了從總RNA溶液中只得到信使mRNA，RNA，使溶液通過含有寡脫氧胸苷酸的柱子〔oligo（dT）〕（CollaborativeResearch，Inc.，Waltham，Massachusetts.）當洗脫核糖體的RNA時，有信使RNA特征的多聚-腺苷酸（poly-A+）尾部附著在柱子上。本方法的結(jié)果，分離出大約90微克多聚-腺苷酸信使RNA（poly-A+mRNA）。在用于cDNA反應之前用氫氧化甲基汞（AlphaVentron，Danvers，Massachusetts）將分離出的poly-A+信息RNA進行預處理。氫氧化甲基汞最終濃度為4毫摩爾，在室溫下處理5分鐘。氫氧化甲基汞處理使得信息RNA無論與其本身，或是與抑制轉(zhuǎn)錄的雜質(zhì)分子之間的相互作用失活。Payvar，etal.，J.Biol.chem.，258，7636-7642（1979）。
根據(jù)Okayama的方法〔Okayama，etal.，MolecularCellularBiology，2，161-170（1982）〕，用從1A6細胞中得到的mRNA制備了一個cDNA庫。然后cDNA通過孵育轉(zhuǎn)化到宿主微生物E.colik-12菌株HBlOl中擴增。
例3
根據(jù)表Ⅳ的hpG-CSFN末端序列設(shè)計的雜交探針是由一組24個寡核苷酸組成，每個長度為23個鹼基，并含有三個次黃嘌呤核苷殘基。寡核苷酸探針是按照Caruthers等人的方法制造的，CeneticEngineering，4，1-18（1982），并用r-32PATP通過多聚核苷酸激酶作用來標記的寡核苷酸探針相當于表Ⅳ中23-30殘基序列的mRNA，詳見表Ⅴ。
表Ⅴ
hpG-CSFProbes
5′GCIGCICCTT3′
把次黃嘌呤核苷定為中性是基于Takahashi等和Ohtsuka等已發(fā)表的工作〔Takahashi，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci（USA），82，1931-1935（1985）和Ohtsuka.etal.，J.Biol.chem.，260，2605-2608（1985）。但是，若次黃嘌呤核苷與G或T配對時，則此鹼基也可能有不穩(wěn)定的效應。在Takahashi等人的方法中，次黃嘌呤核苷可以似乎有中性的效應，因為它們做為一個基因平均起來接近中性（例如，有利于與C配對的有三個和不利于與T配對的有二個）。
為了試驗I鹼基有與G鹼基配對的效應，采用N-myc基因序列和克隆來設(shè)計對照實驗。從N-myc基因中所選擇的序列在每個密碼子的頭兩個位置上具有hpG-CSF探針所規(guī)定的全部相同的G和C成分。所以如同hpG-CSF探針一樣，N-myc的測試探針都是長度相同，所含的I是在同樣的相對位置上，并可能具有相同的平均Tm（62～66℃，不計算所包括的3個或4個次黃嘌吟核苷殘基）。
按照Charuthers等（Supra）的方法構(gòu)建了兩組N-myc的試驗探針。第I組，如在表Ⅵ中所說明的包括：1.23個堿基個體有理想的匹配;2.其中三個第3位的C用I置換，對于添加I產(chǎn)生最不利的可能情況;3.其中四個第3位的C用I置換。第二組測試探針設(shè)計成代表次黃嘌呤堿基對更雜亂的分配，這樣可能得到一個整個中性的堿基配對效果。第Ⅱ組，如在表Ⅵ中所說明的，包括：4.含有兩個I，它們將與C配對，一個與G配對;5.與4相同，外加多于一個I：G鹼基對。
表Ⅵ
N-myc試驗探針
1.5′CACAACTATGCCGCCCCCTCCCC3′
2.5′CACAACTATGCIGCCCCITCICC3′
3.5′CAIAACTATGCIGCCCCITCICC3′
4.5′AACGAGCTGTGIGGCAGICCIGC3′
5.5′AAIGAGCTGTGIGGCAGICCIGC3′
五個復制濾膜，內(nèi)含N-mycDNA序列和雞的生長激素DNA序列（做為空白對照）在雜交之前放入真空爐中在80℃下烘烤2小時。將所有的濾膜進行雜交，如例4中用于hpG-CSF探針的方法相同，但雜交時間只有6小時。濾膜在室溫下洗滌三次，再在45℃下洗一次，每次10分鐘。用Geiger計數(shù)器檢測濾膜。
代表N-myc探針3的濾膜比其它四種探針的濾膜給出的信號更弱，并不能再進一步洗滌。在50℃10分鐘洗滌以后，Geiger計數(shù)器給出如下的百分信號，用常規(guī)探針的為100%，探針2.20%;探針3（45℃），2%;探針4.92%;探針5.75%;在55℃下洗滌以后，其百分數(shù)是：探針2.16%;探針4.100%;和探針5.80%。在60℃最后洗滌產(chǎn)生以下的百分數(shù)：探針2.1.6%;探針4.90%;和探針5.70%。
因此，有三個I出現(xiàn)時，象在探針2和4中，當接近理論Tm（I末包括在計算值內(nèi)）時，觀察到在信號上有高達60倍的差別，〔根據(jù)不利情況的I堿基對（探針2）和相對中性的I鹼基對（探針4）〕。
由N-myc試驗雜交所獲得的標準化信息被用于hpG-CSF雜交的洗滌和檢測（如下所表明的那樣）中測量不夠嚴格的洗滌結(jié)果可能被接受時的可靠程度。
例4
按照Hanahan，等人的方法，J.Mol.Biol.，166，557-580（1983），將含有用cDNA嵌入重組物的細菌（如在例2中所制備的）涂布在平放于瓊脂平皿上的24張硝酸纖維素濾膜上（微孔濾膜，Bedford，Massachusetts）。再把平皿孵育以形成大約150，000個菌落，將其再復制到另外的24張硝酸纖維素濾膜上。培育復制膜直到出現(xiàn)明顯的菌落。將濾膜上的細菌在用氫氧化鈉（0.5摩爾）飽和10分鐘到幾張Whatman3號濾紙上溶菌，再用Tris（1摩爾）吸印2分鐘，然后再用內(nèi)含NaCl（1.5摩爾）的Tris（0.5摩爾）吸印10分鐘。當濾膜接近干時放在真空爐中在80℃下烘烤2小時。再進行核酸雜交?！瞁ahl，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci（USA），76，3683-3687（1979）〕和Maniatis，etal.，Cell，81，163-182（1976）。
在750毫升10×Denhardt′s0.2%SDS和6×ssc中，在65℃下將濾膜預雜交2小時。濾膜經(jīng)6×ssc漂洗，一袋放4片，在6×ssc和10×Deuharolt內(nèi)雜交14小時。每袋約有15毫升溶液，內(nèi)含50×106cpm的32P-標記的探針（寡核苷酸）。
雜交以后，在室溫下將濾膜放在6×ssc中洗滌三次（1升/洗滌），每次10分鐘。再把濾膜放在45℃下洗兩次，每次15分鐘，在50℃下洗一次，15分鐘，在55℃下洗一次，15分鐘，共用1升體積的6×ssc。把濾膜使用一種增感屏和柯達XAR-2膠片。進行放射自顯影，-70℃，2小時，在這種放射自顯影圖上，有40～50個檢測出來的陽性信號，包括5個非常深的信號。
將含有最強的五個信號的區(qū)域和另外五個陽性區(qū)域從主平皿上刮下來再鋪板，使用同樣的探針混合物，在同樣的條件下進行第二次篩選。洗滌方法有些不同，即高溫洗滌包括在55℃兩次，每次15分鐘，再在60℃一次，15分鐘。基于例3的對N-myc探針的研究，在第二次篩選上中最后的洗滌溫度提高了，因為對于24，23聚合體來說聚集物的解鏈溫度是60～68℃，與N-myc探針相同。就在第二個55℃洗滌之后，濾膜還是潮濕時進行放射自顯影。將此放射自顯影圖與第二張同時進行而最后在60℃下洗滌的放射自顯影圖作比較，表明在受測試的10個克隆中當溫度從55℃升至60℃后只有2個在信號上沒有受到重大損失。以后將表明這兩個克隆有接近一致的長度和限制性核酸內(nèi)切酶的圖譜。標明為PPO2的一個克隆被選作測定序列。
由上面方法所得到的重組物hpG-CSFcDNA克隆，pPO2，的序列是用Sanger等的雙脫氧方法完成的，Sanger，etal.，ProcNatl.Acad.Sci.（USA）74，5463-5467（1977）。用單鏈的噬菌體M-13DNA作為克隆載體，提供來自雙鏈cDNA克隆的單鏈DNA模板。Sanger等的方法揭示了此序列，如表Ⅶ中的第四組，并附有它氨基酸轉(zhuǎn)錄和在多肽編碼區(qū)的互補鏈。
表Ⅶ（見下頁）
需要指出表Ⅶ中序列的以下特征。在序列的5′端存在相應于多聚GcDNA連接物的堿基。隨之出現(xiàn)約5個鹼基（用“N”表明），由于前面含有多個G，所以用Sanger等人的方法不容易準確地測出它們的序列。其后展現(xiàn)的是12個密碼子為一組的序列，這些密碼子編碼被認為是多肽的引導序列。根據(jù)在例1中所敘述的與天然hp-CSF分離物相應的氨基末端的序列，被認為是hpG-CSF的“成熟”型的起始蘇氨酸殘基，用+1表示。成熟的hpG-CSF后來被揭示為含有174個殘基（如所示）。后面的“終止”密碼子（OP密碼子，TGA）是大約856個堿基，一種不能轉(zhuǎn)譯的3′序列和多聚A“尾”的多個A。特殊的HgiAi，和ApaⅠ限制性內(nèi)切酶識別的位點，以及兩個stuⅠ的位點（后面討論關(guān)于建造原核生物的和真核生物的表達系統(tǒng)）也都在表Ⅶ中指明了。由于在多肽中缺少天冬酰胺殘基，所以對于N-糖基化作用沒有明顯的位置?？拷?′未譯序列的末端處下面劃線的6個殘基代表潛在的多聚腺苷酸作用的位點。
值得注意的是，用如上所述雜交方法從總數(shù)為450，000個克隆中鑒定的兩個附加的cDNA克隆不包含從轉(zhuǎn)錄的起始位置向前編碼整個引導序列的DNA。的確，所有三個hpG-CSF克隆都準確地在相同位置上終止在5′區(qū)域，這表明轉(zhuǎn)錄的mRNA的二級結(jié)構(gòu)嚴重地防礙著cDNA形成越過此位置。因此，當實際操作時，篩選cDNA的表達，正如Okayama等所述〔Okayama，etal.，Mol.andCell.Biol.，3，280-289（1983）〕和woag等人實際上用于分離GM-CSF的方法〔Wong，etal.，Science，228，810-814（1985）〕并不能很容易地應用于分離hpCSFDNA，因為這樣的分離系統(tǒng)通常依賴于在所分析的克隆中存在有足夠長的cDNA轉(zhuǎn)錄本。
上面的序列在細菌宿主中可靠的直接表達hpG-CSF是穩(wěn)定的。為了保證這種表達，應用起始密碼子ATG提供hpG-CSF的編碼區(qū)，并在合適的啟動子/調(diào)節(jié)子DNA序列控制下把序列插入到轉(zhuǎn)化載體的一個位點上。
例5
在此例中，編碼hpG-CSF的cDNA（如同在前面的例子中所分離出的）被用于篩選一個基因組克隆。λ-噬菌體的人胎兒肝臟基因組庫〔按照Lawn等人的方法制備的。Cell，15，1157-1174（1978）并從T.Maniatisl處得到〕用一個缺口轉(zhuǎn)移的探針來篩選，探針是由兩個用HgiAl和Stul消化而分離出來的hpG-CSFcDNA片段組成，（HgiAItostuI，649b.p.istuItostuI，639b.p.）。將總數(shù)約為500，000的噬菌體涂在12個（15厘米）Petri培養(yǎng)皿上，取出噬菌斑，并用Benton/Davison的方法與探針雜交〔Benton，et，al.，Science，196，180（1977）〕。觀察到總共12個陽性克隆。在二級篩選中，基于放射性自顯影產(chǎn)生最強信號的三個克?。?-3）使之生長在1升的培養(yǎng)基中，并用限制性酶消化制圖，并用放射性標記的24個-寡核苷酸（帶有γ-32PATP的激酶）5′CTGCACTGTCCAGAGTGCACTGTG3′做Southern印跡。圖譜結(jié)果表明分離物1和3都是相同的，而分離物2含有2000附加鹼基5′到hpG-CSF基因上。因此，克隆2被用來做進一步鑒定。由克隆2得到的DNA用Rl進行消化以釋放出一個8500bphpG-CSF，內(nèi)含的片段隨后亞克隆到pBR322上并進一步用限制性核酸內(nèi)切酶消化繪圖，Southern印跡，M13亞克隆和定序列。所得到的序列如在表Ⅷ中所列出的。
表Ⅷ（見下頁）
在圖1中詳細介紹了含有hpG-CSF基因的基因組DNA的限制性核酸內(nèi)切酶圖（大約3.4Kb）。在圖1中所示的限制性內(nèi)切酶有：NcoⅠ，N;PstⅠ，P;BamHⅠ，B;ApaⅠ，A;XhoⅠ，X;和Kpn，K。圖下的箭頭表出了用以獲得基因組序列的定序列步驟。在cDNA克隆中發(fā)現(xiàn)有盒區(qū)，用帶虛線的打開末端的小盒代表不存在于cDNA克隆中的序列，用探測mRNA印跡的方法鑒定。為外顯子檢的編碼序列作鑒定。應用Northern印跡分析法24鏈節(jié)的寡核苷酸探針，5′CAGCAGCTGCAGGGCCATCAGCTT3′，跨越外顯子1和2預定的切接處，以Northern印跡的方式雜交到hpG-CSFmRNA上。產(chǎn)生的印跡顯示mRNA與用外顯子2寡核苷酸探針所見到的有同樣大?。ā?650個鹼基對）。這個數(shù)據(jù)結(jié)合hpG-CSF的直接表達能力定出在外顯子1所含的編碼順序，而hpG-CSF來自psvGM-PPO1載體（例9）采用表Ⅷ中所表明的Met甲硫氨酸起始密碼子。外顯子2-5是由hpG-CSF基因（表Ⅶ）的cDNA克?。≒PO2）所得到的編碼序列確定的。
例6
本例是關(guān)于制備一種人工基因，它能編碼hpG-CSF并含有E.coli優(yōu)選的密碼子。
簡單來說，所使用的方案大體上與共同所有人Alton等在專利公開中所設(shè)計的一樣，PCTPublicationNo.WO83/04053，再加在此處作為參考。設(shè)計基因是為了把寡核苷酸成分先組合成復合的雙倍體，再依次組裝成三個獨立的片段。這些片段的設(shè)計為了易于擴增，當它們從擴增體系中移出時，能按順序組合或通過多片段連結(jié)組合在適宜的表達載體中。
在表Ⅸ到ⅩⅣ中說明了段Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的建造。段Ⅰ的建造，如在表Ⅸ和Ⅹ中說明的，將寡核苷酸1-14組合成7個復體（1和8;2和9;3和10;4和11;5和12;6和13;7和14）。然后連接7個復體形成段Ⅰ，如表Ⅹ所示。還應指出的是在表Ⅹ中段Ⅰ包括一個上流的XbaⅠ粘性末端和一個下流的BamHⅠ粘性末端，這對連接到擴增和表達的載體上以及對于連接到段Ⅱ上都是有用的。
表Ⅸ
EChpG-CSFDNASECTIONI
CTAGAAAAAACCAAGGAGGTAATAAA1
TAATGACTCCATTAGGTCCTGCTTCTTCT2
CTGCCGCAAAGCTTTCTGCTGAAATGTCTGG3
AACAGGTTCGTAAAATCCAGGGTGACGGT4
GCTGCACTGCAAGAAAAACTGTGCGCTA5
CTTACAAACTGTGCCATCCGGAAGAGC6
TGGTACTGCTGGGTCATTCTCTTGG7
CATTATTTATTACCTCCTTGGTTTTTT8
GCAGAGAAGAAGCAGGACCTAATGGAGT9
TGTTCCAGACATTTCAGCAGAAAGCTTTGCG10
CAGCACCGTCACCCTGGATTTTACGAACC11
TAAGTAGCGCACAGTTTTTCTTGCAGTG12
ACCAGCTCTTCCGGATGGCACAGTTTG13
GATCCCAAGAGAATGACCCAGCAGT14
如表Ⅺ和表Ⅻ中所述，在建造段Ⅱ時，是把寡核苷酸15-30組合成8個復體（15和23;16和24;17和25;18和26;19和27;20和28;21和29;22和30）。再將這8個復體連接起來以形成段Ⅱ，如在表Ⅻ中所示。如在表Ⅻ中進一步表明的那樣，段Ⅱ有一個上流的BamHⅠ粘性末端和一個下流的EcoRⅠ粘性末端，這對于連到擴增載體上或是對于連接到段Ⅰ上都是有用的。在其下流端附近，段Ⅱ還含有一個下流的SstⅠ位點，這對最終段Ⅱ和段Ⅲ的連接是有用的。
表Ⅺ
ECHpG-CSFDNASECTIONⅡ
GATCCCGTGGGCTCCGCTGTCTTCT15
TGTCCATCTCAAGCTCTTCAGCTGGC16
TGGTTGTCTGTCTCAACTGCATTCTGGT17
CTGTTCCTGTATCAGGGTCTTCTG18
CAAGCTCTGGAAGGTATCTCTCCGGA19
ACTGGGTCCGACTCTGGACACTCTGCA20
GCTAGATGTAGCTGACTTTGCTACTACT21
ATTTGGCAACAGATGGAAGAGCTCAAAG22
GACAAGAAGACAGCGGAGCCCACGG23
ACCAGCCAGCTGAAGAGCTTGAGATG24
ACAGACCAGAATGCAGTTGAGACAGACA25
CTTGCAGAAGACCCTGATACAGGA26
CAGTTCCGGAGAGAGATACCTTCCAGAG27
TAGCTGCAGAGTGTCCAGAGTCGGACC28
AAATAGTAGTAGCAAAGTCAGCTACATC29
AATTCTTTGAGCTCTTCCATCTGTTGCC30
最后，段Ⅲ的建造如在表ⅩⅢ和ⅩⅣ中所示。為了這個構(gòu)建，將寡核苷酸31～42組合成6個復體（31和37;32和38;33和39;34和40;35和41;36和42）。再把這6個復體連接起來形成段Ⅲ，如在圖ⅩⅣ中所示。在圖ⅩⅣ中還示出，段Ⅲ含有一個上流的BamHⅠ粘性末端和一個下流的EcoRⅠ粘性末端，這對于連接到一個擴增載體上是有用的，至少在EcoRⅠ末端的情況下，有助于連到表達載體上。另外，段Ⅱ有一個上流的SstⅠ位點，這在最終的段Ⅱ和段Ⅲ的連接中是有用的。
表ⅩⅢ
EChpG-CSFDNASECTIONⅢ
GATCCAAAGAGCTCGGTATGGCACCAG31
CTCTGCAACCGACTCAAGGTGCTATGCCG32
GCATTCGCTTCTGCATTCCAGCGTCGTGC33
AGGAGGTGTACTGGTTGCTTCTCATCTG34
CAATCTTTCCTGGAAGTATCTTACCGTGT35
TCTGCGTCATCTGGCTCAGCCGTAATAG36
AGAGCTGGTGCCATACCGAGCTCTTTG37
ATGCCGGCATAGCACCTTGAGTCGGTTGC38
TCCTGCACGACGCTGGAATGCAGAAGCGA39
ATTGCAGATGAGAAGCAACCAGTACACC40
CAGAACACGGTAAGATACTTCCAGGAAAG41
AATTCTATTACGGCTGAGCCAGATGACG42
由段Ⅰ形成的XbaⅠ到BamHⅠ的片斷被連到用XbaⅠ和BamHⅠ打開的M13mpll噬菌體載體上。再將載體用BamHⅠ和EcoRⅠ消化使載體重新打開，然后再將BamHⅠ連到由段Ⅱ形成的EcoRⅠ片斷上，在這個步驟上，已把段Ⅰ和段Ⅱ以適宜的定位聯(lián)結(jié)起來了。下一步，用BamHⅠ到EcoRⅠ消化打開另一個M13mpll載體，再用BamHⅠ連到由段Ⅲ形成的EcoRⅠ片斷上。
用XbaⅠ和SstⅠ消化含有段Ⅰ和段Ⅱ的載體。同樣地，含有段Ⅲ的載體是用SstⅠ和EcoRⅠ消化的。從每一個消化所產(chǎn)生的兩個片斷中，取較小的兩個連到事先用XbaⅠ和EcoRⅠ打開的質(zhì)粒pCFM1156上。這個反應的產(chǎn)物是一個表達質(zhì)粒，內(nèi)含一個連續(xù)的DNA序列，如在表ⅩⅤ中所示，能編碼帶有一個氨基末端的甲硫氨酸密碼子（ATG）一個完整的hpG-CSF多肽，用于啟動E.coli轉(zhuǎn)錄。
雖然任何合適的載體都可用來表達這種DNA，但是表達質(zhì)粒pCEM1156可很容易地由質(zhì)粒pCFM836構(gòu)建，它的構(gòu)建敘述在已發(fā)表的歐洲專利申請№136，490內(nèi)。pCFM836先用NdeⅠ切，再用PolⅠ切齊末端，這樣一來，原有的兩個NdeⅠ位點就都破壞了。下一步，將載體用ClaⅠ和SacⅡ消化以除去一個原有的多聚連接物，然后再連接到一個替換的多聚連接物上，如在表ⅩⅥ中所述。這個取代的多聚連接物可按照Alton等人（見前）的方法建造。在表達pCEM1156質(zhì)粒中控制表達是用λPL啟動子，啟動子本身可受C1857阻遏基因的控制（例如由E.coli菌株K12△Htrp提供）。
表ⅩⅥ
ATCGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTACCAT
TAGCTAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGCCATGGTA
1Clal，12XbaⅠ，29Ndel，35Hincll，Hpal，39Mlul，47EcoRIl
53HgiClKpnl，57NcolStyl，
GGAAGCTTACTCGAGGATCCGCGGATAAATAAGTAACGATCC
CCTTCGAATGAGCTCCTAGGCGCCTATTTATTCATTGCTAGG
63Hindlll，70AvalXhol，75BamHⅠXho2，79Sac2，
例7
本例涉及用編碼〔Met-1〕hpCSF的DNA序列方法的hpG-CSF多肽的E.coli表達，所使用的序列部分是合成的，部分是來自cDNA。合成的序列利用E.coli優(yōu)選的密碼子。
質(zhì)粒PPO2，內(nèi)含hpG-CSF基因（見表Ⅶ），用HgiAⅠ和StuⅠ進行消化，提供大約645個鹼基對的片斷，內(nèi)含由7個在5′端的引導序列殘基的密碼子和3′非-編碼區(qū)的約100個鹼基對的完全hpCSF的基因（如在表Ⅶ中所述），HgiAⅠ消化留下一個5′，4-鹼基的粘性末端，它與PstⅠ的粘性末端一致，同時StuⅠ留下一個平齊末端。這就允許片段易于插入到M13mp8（RF）中，它是用PstⅠ和用形成的平齊末端的限制性酶（HincⅡ）切下來的。在M13中擴增后，用ApaⅠ和BamHⅠ消化切開hpG-CSFDNA，分別切在復蓋hpCSF+3到+5殘基的密碼子的ApaⅠ位點和在M13mp8限制性多聚連接物HincⅡ位點下游的BamHⅠ位點上。為允許使hpG-CSF多肽的E.coli表達，制備了合成的片斷，示于下面的表ⅩⅦ中。
表ⅩⅦ
5′-CTAGAAAAAACCAAGGTAATAAATA
3′-TTTTTTGGTTCCTCCATTATTTAT
XbaⅠ
-1+1
MetThrProLeu
ATGACACCTCTGGGCC-5′
TACTGTGGAGAC-3′
ApaⅠ
從表ⅩⅦ的分析中可以測出，連接物包括：一個ApaⅠ粘性末端，對hpG-CSF的氨基末端中起始的三個殘基特異的密碼子（“再生的”Thr1、Pro2、Len3-特異的密碼子，它在上述M13DNA的ApaⅠ消化中被消掉，并用此密碼子在E.coli中做優(yōu)選表達），一個起動翻譯的ATG，一個24個鹼基對的序列，它提供核蛋白體的結(jié)合位點，和一個XbaⅠ粘性末端。
對E.coli表達所用的表達載體被稱為pCFM536，1985.4.10，由Morris公布的歐洲專利申請No.136，490所述（還可參見A.T.C.C.39934，保藏pCFM536的E.coliJM1013）。簡單地說，質(zhì)粒pCFM536是用XbaⅠ和BamHⅠ消化的。將hpG-CSF片段（ApaⅠ/BamHⅠ）和上述的銜接物（XbaⅠ/ApaⅠ）再往其中連接以形成所期望的p536Ppo2質(zhì)粒。
把質(zhì)粒p536Ppo2轉(zhuǎn)化到一種能抗EcoliAM7菌株變種的噬菌體中，該株先已用含有CI857基因的質(zhì)粒pMWI（A.T.C.C.No39933）轉(zhuǎn)化過了?；谘b在pCFM536祖先質(zhì)粒上的抗性標志基因（Amp）來證實轉(zhuǎn)化。在LB液體培養(yǎng)基（氨芐青霉素50微克/毫升）中的細胞培養(yǎng)物放在28℃保溫，當細胞在培養(yǎng)基中生長到A600＝0.5時，把培養(yǎng)基升溫至42℃，3小時，引起hpCSF表達。培養(yǎng)基的最后O.D.值為A600＝1.2。
被轉(zhuǎn)化細胞hpG-CSF表達的水平是在SDS考馬斯蘭染色的聚丙酰胺凝膠上測定的，為總細胞蛋白量的3～5%。
用離心法收集細胞，在JS-4.2轉(zhuǎn)頭中3500g離心10分鐘。25%（w/v）的細胞水溶液在10，000P.s.i（每平方吋磅）的壓力下三次通過FrenchPressureCell，細胞被破碎。將破碎細胞懸液在JA-20轉(zhuǎn)頭中10，000g下離心15分鐘。將沉淀物再懸浮于水中，在1%月桂酸和50毫摩爾TrisPH8.7中制成約有5毫克/毫升的總蛋白的溶液。溶解了的沉淀物再置于15，000g下離心10分鐘，往上清液中加入CuSO4使成20毫摩爾。1小時后，將此樣品加到C4HPLC柱上進行純化，并按照例1（B）的方法調(diào)節(jié)體積和濃度。
第二種純制方法是用來產(chǎn)生較大量的hpG-CSF，它是在含非有機物的緩沖液中配制的。這種物質(zhì)適合于作體內(nèi)研究。將150克的細胞膏再懸浮于大約600毫升的1毫摩爾DTT中，在大約7000PSI下使通過MantonGualinHomogenizer4次。破碎的細胞懸液在10，000g下離心30分鐘，將此沉淀物再懸浮于400毫升1%脫氧膽酸鹽（DOC）、5毫摩爾EDTA、5毫摩爾DTT和50毫摩爾TrisPH9的溶液中。把這個懸浮液置于室溫下混合30分鐘，再在10，000g離心30分鐘。再將沉淀物懸浮于大約400毫升的水中，在10，000g下離心30分鐘。將沉淀物溶于100毫升2%的Sarkosyl和50毫摩爾（？）PH8。加入CuSO4使成20微摩爾，混合物在室溫下攪拌16小時，再在20，000g下離心30分鐘。往上清液中加入300毫升丙酮。將此混合物置于冰上20分鐘，再在5000g下離心30分鐘。將沉淀物溶于250毫升6摩爾胍和40毫摩爾醋酸鈉，（在PH4）的溶液中，使通過一個1，200毫升的G-25柱，柱在20毫摩爾PH5.4的醋酸鈉溶液中平衡和運行。合并hpG-CSF峰（約400毫升），加到一根15毫升的CM-纖維素柱上，此柱是在20毫摩爾（PH5.4）的醋酸鈉中平衡的。上樣以后，柱子用60毫升20毫摩爾的醋酸鈉（PH5.4），和25毫摩爾氯化鈉沖洗，然后用200毫升20毫摩爾醋酸鈉（PH5.4）和37毫摩爾氯化鈉洗脫柱子。將此洗脫液150毫升濃縮至10毫升并加到300毫升G-75柱上，柱子在20毫摩爾醋酸鈉和100毫摩爾氯化鈉的溶液（PH5.4）中平衡和運行。合并35毫升的峰部分，并過濾滅菌。hpG-CSF的終濃度為1.5毫克/毫升，用凝膠分析方法測定純度大于95%，熱原含量少于0.5微克/0.5毫克hpG-CSF。熱原水平的測定使用LimulusAmeboyteLysate（LAL）測試箱（M.A.Bioproducts，Walkersville，Maryland）。
例8
本例是關(guān)于使用重組的方法生產(chǎn)hpG-CSF的類似物，其中出現(xiàn)在17，36，42，64和74位上的半脫氨酸殘基分別用一合適的氨基酸殘基置換。
按照Souza等人的方法（Souza，etal.，publishedPCTApplicationNoWO85/00817，1985年2月28日公布），將引起誘變的位點在質(zhì)粒p536Ppo2的〔Met-1〕編碼DNA上進行，如下文所述，使用合成的寡核苷酸，其大小范圍從20到23個鹼基如下面在表ⅩⅧ中所列。使寡核苷酸No，1形成編碼〔Ser17〕hpG-CSF基因;使寡核苷酸№.2形成的為〔Ser36〕hpG-CSF，等等。
表ⅩⅧ
寡核苷酸順序
1.5′-CTGCTCAAGTCCTTAGAGCAAGT-3′
2.5′-GAGAAGCTGTCTGCCACCTACA-3′
3.5′-TACAAGCTGTCCCACCCCGAG-3′
4.5′-TGAGCAGCTCCCCCAGCCAG-3′
5.5′-CTGGCAGGCTCCTTGAGCCAA-3′
引起誘變阻礙的Cys到Ser位點是用M13mp10來完成的，其中含有XbaⅠ-BamHⅠhpG-CSF片斷，它是作為模板從p536Ppo2中分離的。從每個含有Cys-Ser取代物的M13mp10克隆中得出的DNA再用XbaⅠ和BamHⅠ處理。將所產(chǎn)生的片斷克隆成表達載體，pCFM746，表達產(chǎn)物的分離如例7。
質(zhì)粒pCEM746可用ClaⅠ和BamHⅠ切開質(zhì)粒pCEM736的方法來構(gòu)建（關(guān)于由存放的和公開買到的材料中制造此物已在Morris的方法中介紹，publishedPCTApplication№.WO85/00829，published1985年2月28日公布），以除去原有的多聚連接物，也可用取代下列的多聚連接物的方法來構(gòu)建。
表ⅩⅨ
ClaⅠ
5′CGATTTGATTCTAGAATTCGTTAACGGTACCATGGAA
3′TAAACTAAGATCTTAAGCAATTGCCATGGTACCTT
GCTTACTCGAGGATCCGCGGATAAATAAGTAAC3′
CGAATGAGCTCCTAGGCGCCTATTTATTCATTGCTAG5′
Sau3a
按照本發(fā)明純化Cys到Ser類似物的方法，將大約10-15克的細胞膏再懸浮于40毫升1毫摩爾的DTT中，使通過FrenchPressureCell，在10，000psi下三次。將破碎細胞懸浮在1，000g下離心30分鐘。將沉淀物再懸浮于1%DOC，5毫摩爾EDTA，5毫摩爾DTT，50毫摩爾Tris，PH9的溶液中，讓它在室溫下混合30分鐘?；旌弦涸?0，000g下離心30分鐘，再懸浮于40ml水中，在10，000g下再離心30分鐘。將沉淀物溶于10毫升2%Sarkosyl，50毫摩爾DTT，50毫摩爾Tris，PH8的溶液中?；旌?小時后，在20，000g下離心30分鐘使混合液澄清，然后加樣到300毫升G-75柱上，用1%Sorkosy1，50毫摩爾的Tris，PH8溶液平衡和運行。合并含類似物的部分，并讓它發(fā)生空氣氧化，即暴露于空氣中放置至少一天。終濃度范圍為0.5～5毫克/毫升。
例9
在本例中，設(shè)計了一種哺乳類動物的細胞表達系統(tǒng)，用以查明是否hpG-CSFDNA的活性多肽產(chǎn)物可在它上面表達并被哺乳類動物細胞所分泌（COS-1，A.T.C.C.CRL-1650）。這一系統(tǒng)用于促使分泌hpGCSF多肽同系物。具體方法是：用帶有被認為是人類GM-CSF殘基序列的多肽引部〔見：Wong，等人，Science，228，810-815（1985）和Lee，等人，Proe.Na+1.Sci（uSA），82.4360-4364（1985）〕，進行編碼〔Ala′〕hpG-CSF的cDNA半合成，半衍生構(gòu)建。該cDNA通過表達和分泌過程提供上述多肽同系物。
在本發(fā)明的多肽產(chǎn)品表達的初步研究中，所使用的表達載體是一種pBR322和SV40DNA的“穿梭”載體，這種設(shè)計允許在E.coli細胞和哺乳類細胞中的自發(fā)復制，在病毒的啟動子/調(diào)控子的DNA序列的控制下，插入的外源DNA在哺乳類動物細胞內(nèi)表達。此載體定名為pSVDM-19并藏匿在E.coliHB101中，于1985年8月23日用AmericanTypeCultureCollection，保存12301ParklawnDrive、Rockville、Maryland，并收到同意號為No.A.T.C.C.53241。
在表達載體構(gòu)建中的專門操作如下。合成了一種引導編碼的DNA序列，如下面表ⅩⅩ中所列。
表ⅩⅩ
-17
HindⅢMetTrp
5′-AGCTTCCAACACCATGTGG
3′-AGGTTGTGGTACACC
-10
LeuGlnSerLeuLeuLeuLeuGlyThrVal
CTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTG
GACGTCTCGGACGACGAGAACCCGTGACAC
-1+1
AlaCysSerIleSerAlaProLeu
GCCTGCAGCATCTCTGCACCCCTGGGCG-3′
CGGACGTCGTAGAGACGTGGGGAC-5′
ApaⅠ
如在表ⅩⅩ中所指明的，序列包括HindⅢ和ApaⅠ粘性末端和可歸之為人類GM-CSF的“引導物”。17個氨基酸殘基的密碼子。跟隨的密碼子就是丙氨酸基，脯氨酸基和亮氨酸基的密碼子。脯氨酸基和亮氨酸基與出現(xiàn)在hpG-CSF的+2位和+3位上的氨基酸對，而丙氨酸基與GM-CSF上的初始氨基端（+1）殘基一致，但與hpG-CSF是不一致的。用丙氨酸代替蘇氨酸是想用來促使相應的宿主細胞通過在GM-CSF分泌過程中通常涉及的細胞機制“加工出”GM-CSF引導物。
質(zhì)粒pSVDM-19用KpnⅠ消化，該位點用Klenow酶將末端鈍化。此后用HindⅢ切割DNA。產(chǎn)生的大片斷，被組合并同示于表Ⅶ的HindⅢ/PvuⅡ片斷相連接（從質(zhì)粒Ppo2分離的由HindⅢ消化和用PvuⅡ部分消化所產(chǎn)生的第2個最大的片斷）以便形成質(zhì)粒pSV-Ppo1。將表Ⅷ中制造的GM-CSF的引導者序列的片斷再連接到pSV-Ppo1上（在用HingⅢ和ApaⅠ將它切開以后）以產(chǎn)生質(zhì)粒pSVGM-Ppo1。
質(zhì)粒pSVGM-PpoⅠDNA的磷酸鈣沉淀物（1～5微克）轉(zhuǎn)化成COS-1細胞60mm復制板，基本上如Wigler等人所述〔Wigler，etal.，Cell，14，725-731（1978）〕。做為對照，也將質(zhì)粒pSVDM-19轉(zhuǎn)化入COS-1細胞。轉(zhuǎn)染后5天收集組織培養(yǎng)基的上清液，并分析hpG-CSF的活性從培養(yǎng)基上清液中獲得〔Ala′〕hpG-CSF的產(chǎn)量為1到2.5微克/毫升的數(shù)量級內(nèi)。
在COS-1細胞中編碼質(zhì)粒pSVGM-Ppo1的〔Ala′〕hpG-CSF產(chǎn)品獲得成功的表達之后，又構(gòu)建了另一個載體，它包括人GM-CSF的引導物序列，但具有在那個位置上置換了丙氨酸密碼子的蘇氨酸基的密碼子（天然出現(xiàn)在hpG-CSF1位置上）。簡短地說合成了寡核苷酸（5′CAGCATCTCTACACCTCTGGG）作為引起突變的位置（SDM）。為了SDM，將在pSVGM-Ppo1中的HindⅢ到BamHⅠhpG-CSF片斷連到M13mp10上。新合成的hpG-CSF基因，在1位上含有一個Thr的密碼子，是用HindⅢ和EcoRⅠ切開分離出來的。再將片斷克隆到用相同的二個限制性核酸內(nèi)切酶切開的方法制備的pSVDM-19中。產(chǎn)生的載體pSVGM-Ppo（Thr）被轉(zhuǎn)化到COS細胞上，并在培養(yǎng)基上清液中測量到的hpG-CSF的產(chǎn)率為1到5微克/毫升范圍。
最后，用基因組序列（它的分離方法介紹在例5中）來形成一種對hpG-CSF的哺乳類動物的細胞有表達的表達載體。更準確地說，用KpnⅠ和HindⅢ消化pSVDM-19，大片段用與帶有HindⅢ和NcoⅠ粘性末端的合成連接物的四路連接中如在表ⅩⅪ中所示。含有外顯子1的NcoⅠ-BamHⅠ片斷是從pBR322中分離出來的，（8500hpG-CSF），一個基因組型克隆？，含有外顯子2-5個BamHⅠ-KpnⅠ片斷是從質(zhì)粒pBR322（8500hpG-CSF基因組型克隆）中分離出來的。產(chǎn)生的哺乳動物表達運載體pSV/ghG-CSF從轉(zhuǎn)化的COS細胞中產(chǎn)生出1到2.5微克/毫升hpG-CSF。
表ⅩⅪ
HindⅢ
5′AGCTTCCAACAC
AGGTTGTGGTAC5′
NcoⅠ
例10
本例是關(guān)于本發(fā)明的重組多肽產(chǎn)品，物理學和生物學特性。
1、分子量
在例7中E.coli表達的重組hpG-CSF產(chǎn)物在還原SDS-PAGE中測定時，具有表觀分子量為18.8KD（千道爾頓）（如從表Ⅶ的氨基酸分析中推斷的），反之純化了的天然分離物（如在例1中所述）具有表觀分子量為19.6KD。與天然分離物在一起的N-聚糖實際上不可能存在，根據(jù)是表Ⅶ中hpG-CSF的初級序列中缺少門冬酰胺基，因此，設(shè)計出一種方法來測定O-聚糖是否在天然分離物和非糖基化的重組產(chǎn)品之間造成分子量差別。用神經(jīng)氨〔糖〕酸苷酶（Calbiochem，LaJolla，California）處理，大約5微克的天然分離物移出0.5微克的樣品，留下的物質(zhì)在37℃與4mU，O-聚糖酶（endo-X-n-acetylgala-ctoseaminidase，Genzyme.Boston，Massachnsetts）孵育。保溫1/2，2，和4小時后分別取出等份樣品。將這些樣品與E.coli產(chǎn)生的重組物質(zhì)并排進行SDS-PAGE。經(jīng)神經(jīng)氨〔糖〕酸苷酶處理以后，分離物的表觀分子量從19.6KD移至19.2KD，啟示除去了Sailicacid基。用O-聚糖酶處理2小時后，分子量移至18.8KD，這與E.coli衍生物的表觀分子量一致。碳水化合物結(jié)構(gòu)對神經(jīng)氨酶和O-聚糖酶的敏感性啟示此碳水化合物成份有下結(jié)構(gòu)：N-乙酰神經(jīng)胺酸-α（2-6）〔半乳糖β（1-3）〕N-乙酰半乳糖胺酸-R，其中R為絲氨酸或蘇氨酸。
2、3H-胸腺嘧啶的攝取
根據(jù)3H-胸腺嘧啶摻入增加，來測定人骨髓細胞的增殖誘導。來自健康的供體的人骨髓用Ficoll-Hypague（1.077g/ml，pharmacia）進行密度分離，將低密度的細胞懸浮于Islove培養(yǎng)基（GIBCO）中，內(nèi)含10%胎牛血清和谷氨酰胺pcn-Strep。隨后，將2×104人骨髓細胞與空白培養(yǎng)基或與例7的重組的E.coli物質(zhì)一起放在96個平底孔的板上，在37℃，在5%CO2氣中保溫2天。分析復制品中的樣品，濃度變化超過10，000倍范圍。然后將培養(yǎng)物用0.5微居里/孔的3H-胸腺嘧啶（NewEnglomdNuclcar，Boston，Massachusetts）輸送脈沖4小時。用Ventua等人的方法測量3H-胸腺嘧啶的攝取，Vcntua，etal.，Blood，61，781（1983）。在這種測定中，人hpG-CSF分離物能誘導3H-胸腺嘧啶摻入到人的骨髓細胞中，以高出對照上清液大約4-10倍的水平。產(chǎn)生例6的hpG-CSG物質(zhì)的大腸桿菌E.coli具有同樣的特性。
第二種人骨髓細胞增殖的研究是用轉(zhuǎn)染COS-1細胞完成的，COS-1細胞是用例9的方法制備，得到相同的結(jié)果，這表明編碼的多肽產(chǎn)物確實作為活性物質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中。
3、WEHI-3BD+的分化誘導
重組的E.coli產(chǎn)生的物質(zhì)對鼠粒單核白血病細胞系WEHⅠ-3BD+的誘導分化的能力是在半固體的瓊脂培養(yǎng)基上，用Metcalf的方法測定的。Int.J.Cancer，25，225（1980）。將重組的hpG-CSF產(chǎn)物和培養(yǎng)基對照都用～60WEHI-3BD+細胞/孔放在一起在37℃下5%CO2氣中保溫7天。將樣品放在24個平底的多孔板上孵育，使?jié)舛茸兓?000倍的范圍以內(nèi)。將菌落分成未分化的，部分分化或全分化的，在顯微鏡下進行菌落細胞計數(shù)。發(fā)現(xiàn)E.coli重組物質(zhì)能誘導分化。
4、CFU-GM，BFU-E和CFU-GEMM的測定
發(fā)現(xiàn)天然的多潛能的人G-CSF（hpG-CSF）分離物和重組的多潛能人G-CSF（rhpG-CSF）都能引起人骨髓細胞的增殖和分化。在CFU-GM〔Broxmeyer，etal.，Exp.Hematol.，5，87，（1971）〕，BFU-E和CFU-GEMM〔Lu，etal.，Blood，61，250（1983）〕的測定中，用低密度非粘連的骨髓細胞（得自健康的志愿者）測量這些活性。使用500單位的hpG-CSF或rhpG-CSF對CFU-GM，BFU-E和CFU-GEmm生物學活性進行比較，示于下面的表ⅩⅫ中。
所有的集落分析都是用低密度非粘連骨髓細胞完成的。使用Ficoul-Hypague（密度，1077克/厘米3;Pharmacia）。對人髓細胞進行密度分離，然后把低密度的細胞再懸浮于含胎牛血清的改良Islove的Dulbello培養(yǎng)基中，放于Falcon組織培養(yǎng)皿（No.3003，BectonDickenson，Cockeysivlle，MD.）中在37℃使粘附1-1/2小時。
表ⅩⅫ
CFU-GMBFU-ECFU-GEMM
培養(yǎng)基0±026±10±0
天然的83±5.483±6.74±0
hpG-CSF
重組的87±581±0.16±2
rhpG-CSF
培養(yǎng)基對照包括改良Iscove的Dulbello培養(yǎng)基加上10%FCS，0.2毫摩爾氯高鐵血紅素和1個單位重組的促紅細胞生成素。
對于CFU-GM測定，是將靶細胞以1×105/ml鋪在0.3%瓊脂培養(yǎng)基上，其中含有輔助的McCoy5A培養(yǎng)基和10%熱失活的胎牛血清。將培養(yǎng)基的集落（每個集合區(qū)中多于40個細胞的）劃線打上記號，并在培養(yǎng)7天時做形態(tài)學評定。集落數(shù)目是以式四份板上測定的平均值±SEM表示。
對于BFU-E和CFU-GEMM測定，將細胞（1×105）加到1毫升混合液中，其中有改良Iscov的Dulbello培養(yǎng)基（Gibco），0.8%甲基纖維素，30%胎牛血清，0.05毫微摩爾2巰基乙醇，0.2毫摩爾氯高鐵血紅素和1個單位重組的促紅細胞生成素。將培養(yǎng)皿放在濕潤的含5%CO2和5%O2的保護氣中培育。使用一種氧氣減壓器（RemingBioinstrumeuts生產(chǎn)，Syracuse.N.Y.）獲得低氧張力。培育14天后把集落打上記號。集落數(shù)目以平均值±SEM表示，是從一式二份的板上測定的。
發(fā)現(xiàn)在CFU-GM分析中所形成集落都是氯乙酸酯酶陽性的和非特異性的酯酶（α-萘酚醋酸酯酶）陰性的，與粒細胞型的集落一致。當在CFU-GM分析中經(jīng)一系列稀釋作分析時發(fā)現(xiàn)不論是天然的hpG-CSF，還是rhpG-CSF都具有大約1×108單位/毫克純蛋白的比活性，在表ⅩⅫ中BFU-E和CFU-GEMM的數(shù)據(jù)是有代表性的三次獨立的實驗，它與以前對天然的hpG-CSF所報導的數(shù)據(jù)相似，值得指出的在E.coli中生產(chǎn)的rhpG-CSF是十分純的，不含有其它可能的哺乳類動物的生出因子。所以當把rhpG-CSF加在有重組的促紅細胞生長素中時，rhpG-CSF，能供養(yǎng)形成混合的集落（CFU-GEMM）和BFU-E。
5、細胞結(jié)合分析
以前曾報導WEHI-3B（D+）細胞和從新近診斷的白血病人中得到的人白血病細胞將結(jié)合125Ⅰ-標記的鼠G-CSF，并因加入未標記的G-CSF或人CSF-β，則可使此結(jié)合完全，測定了天然的hpG-CSF和rhpG-CSF對于125I-hpG-CSF結(jié)合到人和鼠的白血病細胞上去的競爭能力。將高度純化的天然hpG-CSF（純度＞95%，1微克）進行碘化〔Tejedor，等人，Anal.Biochem.，127，143（1982）〕并用凝膠過濾和離子交換層析法把它從反應物中分離出來。天然125Ⅰ-hpG-CSF的比活度大約是？微居里/微克蛋白質(zhì)。測定了鼠的WEHI-3B（D+）和二份人的外周血的粒細胞白血病細胞制備物〔ANLL，一種分類為M4，其它分類為M5B）結(jié)合125Ⅰ-hpG-CSF的能力。
將鼠和新鮮的人外周血髓樣白血病細胞用PBS/1%BSA洗三次。將WEHI-3B（D+）細胞（5×106）或新鮮的白血病細胞（3×106）以一式雙份在PBS/1%BSA（100微升）中，在存在或不存在各種濃度（體積：10微升）的未標記的hpG-CSF，rhpG-CSF或GM-CSF時在有125Ⅰ-hpG-CSF（大約100，000計數(shù)/分或1毫微克）存在時，以及在0℃培育90分鐘。（總體積：120微升）。然后將細胞再懸浮起來，加入200微升冰冷的FCS，放入350微升的塑料離心管中，進行離心使分層（1000g;1分鐘）。切除管末端收集沉淀物，將沉淀和上清液分別用γ計數(shù)器（Packard）計數(shù)。
測定特異性結(jié)合數(shù)（計數(shù)/分），即是在無競爭者存在時的總結(jié)合數(shù)（兩份平均值）減去有100倍過量的未標記的hpG-CSF存在（未特異結(jié)合）時的結(jié)合數(shù)（計數(shù)/分）。非特異性結(jié)合的最大值對于WEHI-3B（D+）細胞是2503計數(shù)/分（CPm），對于ANLL（M4）細胞是1072計數(shù)/分Cpm，對于ANLL（M5B）細胞是1125。實驗1和2是在不同的日期做的，使用同樣的125Ⅰ-hpG-CSF制劑，在對2000單位hpG-CSF的抑制百分數(shù)上呈現(xiàn)本質(zhì)的一致性。所得到的數(shù)據(jù)報告在下面的表ⅩⅩⅢ中。
如表ⅩⅩⅢ所示，證明125Ⅰ-hpG-CSF結(jié)合到WEHI-3B（D+）白血病細胞上。在劑量相關(guān)法中，結(jié)合受到了未標記的天然hpG-CSF或rhpG-CSF的抑制，但不受GM-CSF的抑制。另外，觀察到hpG-CSF能結(jié)合到人的粒單核細胞白血病細胞（ANLL，M4）上。在液體培養(yǎng)基中對天然hpG-CSF反應方面，這些細胞與天然hpG-CSF的結(jié)合與形態(tài)學劃定這些細胞分化為成熟的巨噬細胞相平行。天然的125Ⅰ-hpG-CSF不能結(jié)合到另一個病人的（ANLL，M5B）單核白血病細胞上，這就可以提示某些白血病可能對hpG-CSF有不同表達或缺少對其的受體。rhpG-CSF對于競爭天然的125Ⅰ-hpG-CSF的結(jié)合能力，與天然的hpG-CSF相同，因此可假定受體能很好地識別這兩種形式。
這些研究證明天然的125Ⅰ-標記的hpG-CSF與白血病細胞的結(jié)合與在培養(yǎng)基中天然的hpG-CSF誘導低密度骨髓細胞的粒細胞和單核細胞分化的能力相平行，這些細胞是取自一個急性早幼粒細胞白血病患者（M3）和另一個急性粒細胞白血?。∕2）。將每一個病人的細胞都放在單獨的培養(yǎng)基中或有1×105單位的rhpG-CSF存在的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天。單純培養(yǎng)基孵育的M3對照培養(yǎng)物所得細胞仍然是早幼粒細胞型;而培育在有rhpG-CSF存在的培養(yǎng)基中顯示有成熟型粒細胞，包括晚幼粒細胞，巨大帶狀和分葉的嗜中性白細胞以及單核細胞。此病人的細胞實際分化，對照組計數(shù)100個細胞，100%早幼粒細胞，而對于rhpG-CSF處理的細胞，22%原始細胞加早幼粒髓細胞，7%粒細胞，35%晚幼粒細胞，20%帶狀加分葉的嗜中性白細胞，14%單核細胞和2%巨噬細胞。值得注意的事實是一種多形核粒細胞仍含有明顯的奧爾氏小體，提示至少這種細胞代表一種分化的白血病細胞。第二名粒細胞白血?。∕2）患者的細胞也放在無rhpG-CSF存在的情況下培養(yǎng)4天。在單純培養(yǎng)基中M2細胞培養(yǎng)物的肉眼分析可見大量“原始細胞樣”的細胞，其中某些具有核仁。某些M2細胞，當用rhpG-CSF處理時，分化為成熟的分葉嗜中性白細胞，在中央的中性白細胞內(nèi)顯示出殘留的奧爾氏小體，這啟示分化是發(fā)生在屬于白血病細胞克隆的細胞內(nèi)。從形態(tài)學上估價100個細胞的實際分化顯示出對照細胞100%為原始細胞。而rhpG-CSF處理過的細胞是由43%原始細胞，1%粒細胞，15%晚幼粒細胞，28%帶狀加分葉的嗜中性細胞，2%原始單核細胞和11%單核細胞組成。還檢查了白血病細胞在另外4種rhpG-CSF濃度（5×103，1×104，2.5×104和5×104U/ml，數(shù)據(jù)未列出）下的分化。甚至在rhpG-CSF的最低濃度下（5×103單位/毫升）測試，也有M3（50%）和M2（37%）白血病細胞顯著分化。（不僅是粒細胞的分化）
6、免疫測定
為制備免疫測定用的多克隆抗體，使用的抗原是多潛能的G-CSF，它是由人的膀胱癌細胞系5637（1A6）中純制出來的，制法如例1（B）。此物質(zhì)根據(jù)硝酸銀染色的聚丙酰胺凝膠判定為85%純。給6周的Balb/C小鼠多部位皮下抗原注射進行免疫。將抗原再懸浮于PBS中并用等體積的Freund完全佐劑進行乳化。劑量為每只小鼠每次注射抗原5到7微克。以同樣量的用等體積Freund不完全佐劑乳化的抗原在18天后再給予小鼠以加強免疫。4天以后取小鼠血清，檢測對人的多潛能G-CSF特異的抗體。
用hpG-CSF5微克/毫升（在50毫摩爾碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液中，PH9.2）涂布在架上（Dynateck，Lab.，Inc.，Alexandria，Virginia）的DynatechImmulonⅡRemovawell條上?？子?.25微克（體積150微升）涂布。將涂有抗原的板置于室溫下保溫2小時，在4℃下過夜。潷去溶液并將板用PBS培養(yǎng)30分鐘，內(nèi)含5%BSA以封閉易反應的表面。將溶液潷出并在免疫前進行稀釋或?qū)y試血清加到孔中并在室溫下保溫2小時。用含1%BSA的PBS，PH7.0稀釋血清。然后潷去血清溶液并用洗液（KPL，Gaithersburg，Maryland）把板洗三次。將大約200，000計數(shù)/分（CPm）碘化了的兔子抗鼠IgG（NEN，Boston，Massaclusetts），在50微升PBS中，PH7.0、含有1%BSA，加入到每一個孔中。在室溫下培育1-1/2小時后，潷出溶液，并將板用洗液洗5次。將孔從架上取出并放在貝克曼5500γ計數(shù)器上計數(shù)。當1∶100稀釋時高滴度的小鼠血清顯示有較高的反應性，比相應的免疫前的血清大12倍。
用對高滴度的鼠血清的反應性來測定E.coli-衍生的hpG-CSF免疫學特性，這種血清是對哺乳類動物細胞產(chǎn)生的hpG-CSF有特異性的。將0.25微克90%純的E.coli-衍生的蛋白質(zhì)（50微升體積）涂布到ImmulonⅡRemovawells上并如上所述分析鼠血清。
當1∶100稀釋時，高滴度的鼠血清對E.coli-衍生的物質(zhì)顯示有較高的反應性，比相應的免疫前的血清的高24倍。
7、絲氨酸類似物的生化分析
〔Ser17〕hpG-CSF，〔Ser36〕hpG-CSF，〔Ser42〕hpG-CSF，〔Ser64〕hpG-CSF，和〔Ser74〕hpG-CSF，按照例9方法所制備的上述產(chǎn)品，在3H-胸腺嘧啶攝取，CFU-GM，和WEH13BD+分析中測定hpG-CSF的活性。在每一個測試中，〔Ser17〕類似物具有的活性類似于具有天然結(jié)構(gòu)的重組分子活性。其余的類似物，在3H-胸腺嘧啶攝取分析中活性大約低100倍，在CFU-GM分析中活性低250倍，在WEHI-3BD+分析中活性低500倍。這些數(shù)據(jù)支持在36，42，64和74位置上的半脫氨酸可能需要，完整的生物學活性這一主張。
8、體內(nèi)生物測定
在7支雄性Syriangolden地倉鼠上將Alzet滲透泵（AlzetCorp.，PaloAlto，CA;Model2001）插入右頸靜脈的導管中并埋入皮下。4個泵中含有緩沖液〔20毫摩爾醋酸鈉（PH5.4）和37毫摩爾氯化鈉〕和1.5毫克/毫升E.coli-衍生的hpG-CSF，而3個泵僅有緩沖液。對于滲透泵要求泵唧速率為1微升/小時。實驗進行7天。在植入泵以后的第3天時，4支處理過的倉鼠的平均粒細胞計數(shù)比3支（緩沖液）對照的高6倍，并且總淋巴細胞數(shù)增加4倍也反映了粒細胞計數(shù)的增加。經(jīng)處理紅細胞計數(shù)不變。這些結(jié)果表明重組物質(zhì)在哺乳類動物中對粒細胞的產(chǎn)生和/或釋放能產(chǎn)生一種特異性的增強作用。
除了天然存在的幾種hpG-CSF的等位型以外，本發(fā)明還包括其它幾種hpG-CSF產(chǎn)物，例如hpG-CSF的多肽類似物和hpG-CSF的片段。按照上面注明的用Alton等人公開申請的操作過程（WO/83/04053），任何人都可很容易地設(shè)計和制造基因，它能給微生物表達的多肽編碼，這些多肽具有在一個或多個殘基的的確定或定位上不同于那些在這當中已被規(guī)定的一級結(jié)構(gòu)。（例如取代，末端和中間的添加和消除）。再有，用已知的位點-定向的突變技術(shù)可很容易地完成cDNA和染色體基因的修飾，并用于產(chǎn)成有關(guān)的類似物和衍生物。這些產(chǎn)物具有至少一種hpG-CSF的生物學特性，但其它特性可能有區(qū)別。例如，本發(fā)明設(shè)計的產(chǎn)品包括那些已被縮小的（例如用刪除法）;或是那些對水解更穩(wěn)定的（因此，比天然存在的可能具有更明顯的或更長的持久效應）;或是那種已被更換成對O-糖基化作用少去一個或多個可能位點的（這對酵母生成的產(chǎn)物可能得到更高的活性）;或是那種有一個或多個被消除或被置換的半胱氨酸殘基的（例如被丙氨酸或絲氨酸基置換并可能更容易以活性形式從微生物系統(tǒng)中分離出來）;或是那些具有一個或多個被苯丙氨酸置換的酪氨酸殘基并可能或多或少更容易結(jié)合到靶細胞的hpG-CSF受體上的。還包括有一些多肽片斷，僅與連續(xù)氨基酸序列中的一部分或hpG-CSF中二級構(gòu)象的一部分相符合，這些片段可能具有一種活性（例如受體結(jié)合）而沒有其他的活性（例如刺激群落生長的活性）。值得注意的是，對于本發(fā)明的任何一個或多個有治療用處的或用在其他范圍（例如在hpG-CSF拮抗作用的分析中）的產(chǎn)品來說那種活性不是必須的〔見Weiland，etal.，Blut，44，173-175（1982）〕。競爭性拮抗劑可能相當有用，例如，在hpG-CSF過量產(chǎn)生時。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，在這當中所敘述的那種能編碼hpG-CSF多肽的DNA序列是有價值的，它提供了有關(guān)的哺乳類動物蛋白質(zhì)的氨基酸序列的資料，這種蛋白質(zhì)至今還沒有被利用，盡管已經(jīng)分析了天然存在產(chǎn)物的分離物。在把各種重組技術(shù)用于進行大規(guī)模微生物合成hpG-CSF時，DNA序列作為產(chǎn)品也是有明顯價值的。換句話說，本發(fā)明所提供的DNA序列有助于形成新的和有用的病毒質(zhì)粒DNA載體和環(huán)狀質(zhì)粒DNA載體，新的和有用的被轉(zhuǎn)化和被轉(zhuǎn)染的微生物原核的和真核的宿主細胞（包括細菌和酵母細胞以及在培養(yǎng)基中生長的哺乳類動物的細胞），以及新的和有用的方法，培養(yǎng)這些微生物的宿主細胞生長，使能表達hpG-CSF和它的相關(guān)產(chǎn)物。
在分離hpG-CSF和與編碼人的基因組DNA和其它哺乳類動物的cDNA和基因組DNA有關(guān)的蛋白質(zhì)時，做為標記探針使用，本發(fā)明的DNA序列也是明顯合適的材料。DNA序列還可用于蛋白質(zhì)合成的各種替換方法中（例如，在昆蟲細胞中）或用于人和其他哺乳類的遺傳治療中。在建立基因突變的哺乳類動物的種屬時，它們可用做真核生物的“宿主”來大量產(chǎn)生hpG-CSF和hpG-CSF產(chǎn)物，就這方面來說，本發(fā)明的DNA序列預期也是有用的。一般性地，見Palmiter，etal.，Science，222（4625），809-814（1983）。
關(guān)于本發(fā)明的hpG-CSF片段和多肽類似物的適用性見合成肽免疫活性的一些報告，這些肽實際上重復了天然存在的蛋白質(zhì)、糖蛋白和核蛋白中現(xiàn)存的氨基酸序列。更具體地說，已經(jīng)表明較低分子量的多肽所參與的免疫反應，與生理學上有意義的蛋白質(zhì)（例如病毒抗原，多肽激素，等等）的免疫反應，在持續(xù)時間和范圍上都是一樣的。這些多肽的免疫反應包括免疫活性動物中引起特異性免疫抗體的形成。參見：Lerner，elal.，Cell，23，309-310（1981）;Ross，etal.，Nature，294，654-656（1981）;Walter，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.（USA），77，5197-5200（1980）;Lerner，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.（USA），78，3403-3407（1981）;Walter，etal.，Proc.Natl.Acael.Sci.（USA），78，4882-4886（1981）;Wong，etal.，Proc.Natl.Acael.Sci.（USA）.78，7412-7416（1981）;Green，etal.，Cell，28，477-487（1982）;Nigg，etal.，Proc.Natl.Acael.Sci（USA），79，5322-5326（1982）;Baron，etal.，Cell，28，395-404（1982）;Dreesman，etal.，Nature，295，185-160（1982）;和Lerner，ScientificAmerican，248，№2，66-74（1983）。合成的多肽大致上具有肽激素的二級結(jié)構(gòu)，但并不具有它們的一級結(jié)構(gòu)構(gòu)象，關(guān)于合成肽類的生物活性和免疫活性，還可參見Kaiser，etal.，Science，223，249-255（1984）。
雖然已經(jīng)對本發(fā)明做了十分具體化的說明，但是應該理解那些工藝熟練者還會提出改動和修正。因此，打算用附加的權(quán)利要求概括所有這些等效的變動，把它們作為權(quán)利要求歸入本發(fā)明范圍內(nèi)。