(一)本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種酶解聯(lián)合超聲波提高收粉靈芝多糖提取得率的方法。

背景技術(shù)：

0、(二)背景技術(shù)

1、中藥材靈芝為多孔菌科(polyporaceae)真菌赤芝(ganoderma?lucidum)或紫芝(ganoderma?sinense)的干燥子實體。靈芝包含多糖、三萜、多肽、核苷、甾醇、生物堿等多種生物活性成分。其中，多糖和三萜最受關(guān)注，它們的含量是衡量靈芝品質(zhì)的重要指標(biāo)。例如，2020版《中國藥典》一部規(guī)定，中藥材靈芝的多糖含量不得少于0.90％，三萜及甾醇(以齊墩果酸計)的含量不得少于0.50％。

2、近年來，隨著靈芝食藥價值的不斷發(fā)掘，消費者對于靈芝類產(chǎn)品的追捧熱情不斷升溫，靈芝栽培技術(shù)和深加工技術(shù)迅速發(fā)展，靈芝孢子粉、靈芝糖漿、靈芝孢子油、靈芝浸膏等一系列精深加工產(chǎn)品應(yīng)運而生，且市場規(guī)模不斷擴大。這些產(chǎn)品中，靈芝孢子粉因其功效顯著而成為最受消費者青睞的產(chǎn)品，其在靈芝類產(chǎn)品中占據(jù)40％以上的份額，所以，以孢子粉為目標(biāo)產(chǎn)品的靈芝栽培占其總栽培面積的一半以上。

3、靈芝孢子粉是在靈芝生長成熟之后，從靈芝菌蓋下方自然彈射而出的孢子，業(yè)內(nèi)習(xí)慣將以產(chǎn)孢子為主要目標(biāo)產(chǎn)品的靈芝子實體稱為“收粉靈芝”、“套袋靈芝”或“套筒靈芝”。收粉靈芝的生長期往往長達9～10個月，是普通靈芝栽培周期的3～5倍，在子實體不產(chǎn)孢子后即被拔除。由于收粉靈芝生長期長、纖維化程度高，活性成分含量低，不適合作為藥用靈芝直接使用，如用于提取多糖或三萜，因提取得率低，經(jīng)濟效益不佳，所以，收粉靈芝也逐漸淪為靈芝孢子粉產(chǎn)業(yè)鏈上的低價值副產(chǎn)品，并隨著孢子粉產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展和壯大，大量被拔除的收粉靈芝常常被種植戶作為廢棄物處理。

4、大量收粉靈芝因經(jīng)濟附加值低，未得到足夠重視與充分利用，造成潛在產(chǎn)業(yè)資源浪費。若開發(fā)出一套適用于收粉靈芝深加工的新技術(shù)，提升其經(jīng)濟價值，進一步釋放靈芝產(chǎn)業(yè)發(fā)展?jié)撃?、提高產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟效益，這對收粉靈芝種植戶增產(chǎn)增收和產(chǎn)業(yè)節(jié)能減排有重要現(xiàn)實意義。

5、靈芝多糖因具有廣泛生理活性備受關(guān)注，在免疫調(diào)節(jié)、輔助抗腫瘤、抗衰老、抗糖尿病、保護心腦血管、保肝解毒等方面有作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、保健、化妝品行業(yè)。目前關(guān)于普通靈芝多糖提取的研究報道較多，基本方法為熱水提取法，在此基礎(chǔ)上采用超聲波、微波和酶解等輔助措施提取，都能顯著提高多糖提取得率，但收粉靈芝纖維化程度高，這些方法或所用酶解條件不適用于其多糖提取。

6、近年來，酶解技術(shù)在食用菌和植物多糖提取中廣泛應(yīng)用。該技術(shù)利用纖維素酶、果膠酶或蛋白酶等，在適宜條件下水解食用菌或植物原料，水解其細(xì)胞壁，有利于胞內(nèi)多糖在提取時溶出。酶解輔助法不僅能顯著提高提取得率，而且條件溫和，不會破壞提取物中活性成分結(jié)構(gòu)，還可降低多糖分子量，使得提取的多糖生物活性更好。

7、為開發(fā)適用于收粉靈芝多糖的提取方法，本發(fā)明采用酶解聯(lián)合超聲波輔助提取法，使收粉靈芝多糖提取得率較高，從而確保以收粉靈芝為原料提取多糖的工業(yè)化生產(chǎn)能獲得更好經(jīng)濟效益。

技術(shù)實現(xiàn)思路

0、(三)
技術(shù)實現(xiàn)要素：

1、本發(fā)明目的是提供一種酶解聯(lián)合超聲波提高收粉靈芝多糖提取得率的方法，本發(fā)明將纖維素酶的酶解技術(shù)和超聲波提取技術(shù)應(yīng)用于收粉靈芝多糖的提取，經(jīng)纖維素酶酶解后的收粉靈芝，再通過熱水和超聲波提取多糖，其多糖提取得率顯著提高。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

3、本發(fā)明提供一種酶解聯(lián)合超聲波提高收粉靈芝多糖提取得率的方法，所述方法包括如下步驟：

4、(1)收粉靈芝經(jīng)切片、干燥和粉碎，所得收粉靈芝粉加入去離子水和纖維素酶，攪拌均勻，構(gòu)成收粉靈芝酶解體系；

5、(2)收粉靈芝酶解體系于溫度35～45℃的水浴中酶解3～5h，然后在沸水中浸提2～3h，再于超聲波中，水溫30～40℃提取30～45min后過濾，收集濾液，獲得收粉靈芝水提液；

6、(3)收粉靈芝水提液濃縮至原體積的1/20～1/30，加入乙醇使多糖沉淀，沉淀物經(jīng)無水乙醇洗滌，真空干燥后，獲得收粉靈芝多糖提取物。

7、進一步，步驟(1)中的收粉靈芝是人工栽培赤芝(ganoderma?lucidum)的子實體，用于收集靈芝孢子粉，在不再產(chǎn)生孢子后拔除，自然晾干；所述的收粉靈芝粉是收粉靈芝切成厚度2～3mm的薄片，85℃烘干至恒重，然后粉碎并過20目篩得到的粗粉。

8、進一步，步驟(1)所述的去離子水的ph＝5.0～5.5(1mol/l的hcl或naoh調(diào)節(jié))；加入體積以收粉靈芝粉質(zhì)量計為30～35ml/g[即料水比為1:30～1:35(g:ml)]。

9、進一步，步驟(1)所述的纖維素酶加量以收粉靈芝粉質(zhì)量計為1750～2100u活力/g。

10、進一步，步驟(2)所述超聲波的頻率為40khz，功率是120～160w。

11、進一步，步驟(3)中的收粉靈芝多糖提取物的制備方法為：收粉靈芝水提液于60℃、相對真空度-0.1mpa條件下減壓濃縮至原體積的1/20～1/30后，再加入濃縮液體積3～4倍的無水乙醇，使體系的乙醇體積濃度達到75％～80％，4℃條件下靜置12～18h后，8000×g離心5～10min，收集沉淀物；沉淀物用原料收粉靈芝粉質(zhì)量計2～4ml/g的無水乙醇洗滌一次，再次離心后沉淀物于65℃、相對真空度-0.1mpa條件下真空干燥至恒重，獲得收粉靈芝多糖提取物。

12、進一步，本發(fā)明所述的酶解聯(lián)合超聲波輔助提高收粉靈芝多糖提取得率的方法，具體按以下步驟操作：

13、(1)自然晾干的收粉靈芝，切成厚度2～3mm的薄片，經(jīng)85℃烘干至恒重，粉碎后過20目篩，得收粉靈芝粉；

14、(2)收粉靈芝粉于燒杯中，加入以收粉靈芝粉質(zhì)量計30～35ml/g、ph＝5.0～5.5的去離子水[即料水比為1:30～1:35(g:ml)]，加入以收粉靈芝粉質(zhì)量計1750～2100u活力/g的纖維素酶，攪拌均勻，構(gòu)成收粉靈芝酶解體系；

15、(3)收粉靈芝酶解體系于溫度35～45℃的水浴中酶解3～5h，轉(zhuǎn)入沸水中浸提2～3h，再于功率120～160w、水溫30～40℃的超聲波(頻率為40khz)中，提取30～45min，酶解體系經(jīng)過濾，收集濾液，得收粉靈芝水提液；收粉靈芝水提液于60℃、相對真空度-0.1mpa條件下減壓濃縮至原體積的1/20～1/30后，再加入濃縮液體積3～4倍的無水乙醇，使體系的乙醇體積濃度達到75％～80％，4℃條件下靜置12～18h后，8000×g離心5～10min，收集多糖沉淀；多糖沉淀用原料收粉靈芝粉質(zhì)量計2～4ml/g的無水乙醇洗滌一次，再次離心后沉淀物于65℃、相對真空度-0.1mpa條件下真空干燥至恒重，獲得收粉靈芝多糖提取物。

16、本發(fā)明提供一種所述方法制備的靈芝多糖。

17、本發(fā)明還提供一種所述靈芝多糖在制備抗氧化劑中的應(yīng)用。

18、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：

19、本發(fā)明用纖維素酶對收粉靈芝進行酶解，纖維素酶能夠水解收粉靈芝細(xì)胞壁中的纖維素，使細(xì)胞壁破損；再用熱水和超聲波提取，超聲波的空穴效應(yīng)能增強物質(zhì)分子的運動頻率和速度，酶解和超聲波聯(lián)合作用有助于細(xì)胞壁中與纖維素結(jié)合的多糖溶出，提取得率顯著提高。本發(fā)明提供的酶解聯(lián)合超聲波輔助提取收粉靈芝多糖的方法，較不采用酶解的提取相比，收粉靈芝多糖提取得率可以提高82.9％。