本發(fā)明涉及一種祛痰藥和使用這種祛痰藥排痰的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及一種由N-乙酰神經(jīng)氨酸及其可供藥用的鹽組成的祛痰藥（這種祛痰藥具有直接增強纖毛運動的作用并能影響痰的流變學性質(zhì)）以及使用這種祛痰藥排痰的方法
在人體的氣管中有粘性分泌物，這些分泌物對賦于吸入空氣以適當?shù)臏囟群蜐穸确矫嫫鹬匾饔?。這種稱之為“痰”的東西主要是由這些分泌物組成的。
當氣管分泌物的數(shù)量適中時，它總是隨著呼吸被無意識地吞入和排出，但從不被咳出。因此，任何咳痰動作都意味著呼吸系統(tǒng)中存在異常情況。另一方面，在氣管內(nèi)積存有待咳出的痰就有可能通過氣管引起感染。根據(jù)這一觀點，對于患呼吸道疾病的病人來說，祛痰無疑地在他們的治療中有重要意義。
痰通常是極粘稠的所以咳痰常常使病人感到痛苦。因此，為了便于排痰常使用稱之為“祛痰藥”的藥物，一般這類藥是口服或注射給藥。這種祛痰藥通過增加氣管粘膜分泌使痰稀釋促進它與粘膜的分離和增強纖毛擺動來使痰易于排出。然而，全身性給藥常涉及到各種各樣有關(guān)機制和作用的臨床問題。
因此本發(fā)明經(jīng)過深入研究后發(fā)現(xiàn)，唾液酸可以作為有效的祛痰藥，并且可以局部給藥。在研究了唾液酸中N-乙酰神經(jīng)氨酸及其鹽的作用的基礎(chǔ)上提出了本發(fā)明。
所以，本發(fā)明的目的是提供一個祛痰藥（它主要是由N-乙酰神經(jīng)氨酸或其鹽組成），以及局部給予此祛痰藥直接增強纖毛擺動和影響痰的流變學性質(zhì)從而使痰易于排出的方法。
圖1和圖2表示N-乙酰神經(jīng)氨酸對纖毛細胞交替運動的作用。
圖3和圖4表示間羥叔丁腎上腺素和乙酰膽堿對纖毛細胞交替運動的作用。
A有效成分
本發(fā)明的祛痰藥含有效成分N-乙酰神經(jīng)氨酸或其鹽，其通式如下所示：
當n＝1時，Z表示氫、鋰、鉀、鈉、銨、有機胺或有機銨;當n＝2時，Z表示鈣、鋇或鎂。N-乙酰神經(jīng)氨酸本身是已知化合物，它的鹽可以通過金屬或堿土金屬的氫氧化物或碳酸鹽中和酸后，將生成的堿金屬或堿土金屬鹽分離而得。
根據(jù)本發(fā)明，此化合物可用已知的局部給藥方法如通過氣霧劑吸入粉末的給藥形式。
（B）機制
N-乙酰神經(jīng)氨酸及其鹽可以作為祛痰藥是基于它的下述兩種功能即通過影響痰的流變學性質(zhì)如流動性、塑變值、拉絲性、粘性、張力松弛時間等和直接增強纖毛的擺動加快痰的移動，這兩種作用產(chǎn)生使痰容易排出的生理學改變。這些功能可通過給予N-乙酰神經(jīng)氨酸或其鹽前后，純毛族交替運動情況的對比試驗，用人氣管纖毛細胞的試驗以及給予N-乙酰神經(jīng)氨酸前后蛙腭粘膜纖毛的痰輸送性能的對比試驗等加以確證。
（C）劑型
臨床應(yīng)用時，本發(fā)明祛痰藥采用下述制劑劑型。
制備實施例
首先，將N-乙酰神經(jīng)氨酸或其鹽在璋腦研磨內(nèi)研磨混合，使其粒度在1～20毫米之間，然后慢慢加入乳糖與粉末混合，稀釋至10～20倍，將20～40毫克混合物用已知的方法裝入膠囊或滴丸內(nèi)，如為粉末溶膠則最好用膠囊，如為液體溶膠則用滴丸。
（D）給藥劑量安排
祛痰藥是用粉末溶膠還是液體溶膠劑型取決于病人的癥狀。劑量一般為0.5～5毫克/次，每天至少應(yīng)給藥2次，但如需要可以改變。
藥效學試驗和急性毒性試驗結(jié)果表明，每天的給藥次數(shù)不需要加以限制。
如用粉末溶膠劑型給藥時，可用粉末噴霧器如吸入器或噴霧器。如用液體溶膠劑型給藥時，可用液體霧化器，如噴霧器。
下面將敘述本發(fā)明化合物的合成并通過推薦實施例介紹作用。
實施例1
N-乙酰神經(jīng)氨酸銨鹽的合成
將12克N-乙酰神經(jīng)氨酸溶于150毫升水中，然后于攪拌下將飽和氨水溶液加入所得的溶液中，直至溶液呈中性（PH6.7），將反應(yīng)液自然過濾，濾渣經(jīng)冷凍干燥（一日）后，得13.2克白色結(jié)晶。
熔點：約150℃（分解），
銨鹽的定性反應(yīng)：
根據(jù)日本藥典第十版所述的一般試驗方法將過量的氫氧化鈉試劑加入銨鹽中，混合物加熱，此時混合物應(yīng)產(chǎn)生氨味，并且生成之煙霧能使紅石蕊試紙變蘭。
（元素分析）
N-乙酰神經(jīng)氨酸銨鹽-水合物
C11H22O9N2·H2O
計算值測定值
C：38.48%C：38.11%
H：7.05%H：6.92%
N：8.16%N：8.17%
O：46.60%（O：46.80%）
實施例2：
N-乙酰神經(jīng)氨酸鈣鹽的合成方法
于10.1克（0.0323克分子）N-乙酰神經(jīng)氨酸和1.162克（0.0162克分子）碳酸鈣的混合物中加入200毫升蒸餾水，混合物于室溫下攪拌2小時，直至碳酸鈣完全溶解（PH6.55），溶液過濾，沉淀物經(jīng)冷凍和減壓干燥，得11.0克無色針狀結(jié)晶。
熔點：140℃以上（分解）
鈣鹽的定性試驗
根據(jù)日本藥典第十版的一般試驗方法
（1）鈣鹽的火焰反應(yīng)試驗應(yīng)呈淡黃紅色
（2）當于鈣鹽內(nèi)加入碳酸銨試劑時，可觀察到有白色沉淀生成
（IRUKBrmaxcm-1）3600～3000，1620，1560
（NMR（D2O）ppm）1.59～2.42（m），2.05（s），3.71（s），3.99（s）
按上述方法還制備了N-乙酰神經(jīng)氨酸的鋰、鉀、鈉、有機銨、鋇和鎂鹽，即用這些元素的氫氧化物或碳酸鹽中和N-乙酰神經(jīng)氨酸，隨后經(jīng)冷凍干燥，即得N-乙酰神經(jīng)氨酸的鹽。
實施例3：
N-乙酰神經(jīng)氨酸和N-乙酰神經(jīng)氨酸鹽對蛙腭粘膜纖毛的作用
（1）試驗動物
用量300～450可的牛蛙（Saitama試驗動物公司提供），不分雌雄。
（2）試驗材料
試驗材料為N-乙酰神經(jīng)氨酸和N-乙酰神經(jīng)氨酸鈣鹽（KantoIshiseiyakuKabushikiKaisha公司提供）以及氯化乙酰膽堿（SigmaKabushikiKaisha公司提供）。
（3）試驗方法
用測定顆粒輸送的方法來測定粘膜纖毛的輸送運動。將牛蛙斷頭處死，然后將腭粘膜分離出（注意要盡可能不把它損壞）并將它固定在陪替（petri）氏培養(yǎng)皿內(nèi)的軟木板上，然后注入20毫升林格氏溶液（三鹽酸）。在開始測量前讓腭粘膜在上述條件下放置30分鐘。測量時將林格氏溶液放凈，將2通過5號藥篩（但不能通過6號篩）的細軟木塊放在腭粘膜表面上，然后測定軟木塊移動1厘米所需的時間（鞍秒針計算）。移動時間即移動速度也在放凈林格氏溶液或藥物溶液后立即測量。
（4）結(jié)果
試驗證明，N-乙酰神經(jīng)氨酸及其鈣鹽能加速腭粘膜纖毛的運動，其作用與劑量有關(guān)。見表1和表3所示。
這個結(jié)果與乙酰膽堿（對照組）在濃度為10-5和10-4克/分子下所產(chǎn)生的結(jié)果基本上相同，見表2所示。
（5）評價
試驗證明，N-乙酰神經(jīng)氨酸及其鈣鹽和N-乙酰神經(jīng)氨酸膽堿（一種已知能促進纖毛運動的物質(zhì)）一樣能產(chǎn)生同樣明顯的促進纖毛運動的作用。因此，預(yù)期N-乙酰神經(jīng)氨酸及其鈣鹽會有助于排痰。雖然乙酰膽堿能促進纖毛運動，然而因為它能引起不良反應(yīng)如支氣管收縮和促分泌作用等，所以不能一種祛痰藥。相反，N-乙酰神經(jīng)氨酸及其鈣鹽可用作祛痰藥，因為它能有效地促進纖毛運動，又不會引起如乙酰膽堿樣的有害作用。
表1N-乙酰神經(jīng)氨酸對纖毛運動的影響
藥物克/毫升移動（秒/厘米）加速（%）＊
蛙數(shù)蛙數(shù)
12341234
對照-32.032.740.336.0000
N-.乙酰-10-521.327.328.724.733.416.528.231.4
神經(jīng)氨酸10-417.322.020.722.045.932.748.238.9
加速（%）＝（1-時間（給藥組）/時間（對照組））×100
表2乙酰神經(jīng)氨酸對纖毛運動的影響
藥物克/毫升移動（秒/厘米）加速（%）＊
蛙數(shù)蛙數(shù)
123123
對照-45.037.039.3000
乙酰膽堿10-527.029.726.340.019.733.1
10-421.021.720.753.341.447.3
加速（%）＝（1-時間（給藥組）/時間（對照組））×100
表3N-乙酰神經(jīng)氨酸鈣鹽對纖毛運動的影響
藥物克/毫升移動（秒/厘米）加速（%）＊
蛙數(shù)蛙數(shù)
123123
對照-37.740.037.0000
N-乙酰10-525.029.324.333.728.034.2
神經(jīng)氨酸鈣10-423.029.019.739.028.746.8
加速（%）＝（1-時間（給藥組）/時間（對照組））×100
實施例4：
N-乙酰神經(jīng)氨酸及其鈣鹽對纖毛細胞交替運動的影響
（目的）
用人氣管和蛙腭纖毛細胞觀察給予N-乙酰神經(jīng)氨酸及其鈣鹽前后，因纖毛擺動而引起的細胞族交替運動變化，以確定這些物質(zhì)對纖毛細胞的影響。
（方法）
用支氣管窺鏡觀察時摩擦支氣管將纖毛細胞分離從正常人氣管中取出纖毛細胞，然而收集。用摩擦蛙腭粘膜收集纖毛細胞時，不需特別小心。將收集到的纖毛細胞懸浮于Medium199（Gibco公司配制）介質(zhì)中，然后將細胞簇（每族含若干細胞，在纖毛擺動時能產(chǎn)生交替運動）用微量注射器吸?。ú僮鲿r用位相顯微鏡觀察，注意要避免損傷這些細胞），再轉(zhuǎn)移到蓋玻片上，并加入一滴雞血漿（Difco公司制備）和一滴50%的雞胚提取物，此時即生成凝塊。用顯象記錄器記錄凝塊的交替運動，并測出每分鐘交替運動的次數(shù)。將藥物溶于Medium199介質(zhì)中，然后通過一根接有蓮蓬頭的管子將藥物注入。用量象記錄器記錄注入5分鐘、10分鐘和15分鐘后的運動情況，并測定交替運動次數(shù)。
（結(jié)果）
當加入N-乙酰神經(jīng)氨酸（10-1～10-4毫克/毫升）時，在加入藥物后立即使纖毛的擺動運動逐漸加速，在加入5、10和15分鐘后（10-3～10-2毫克/毫升）出現(xiàn)一個平頂，在此階段每分鐘的擺動運動速度比在Medium199介質(zhì)中時要高25%，如圖1和2所示。同時也觀察到加入10-3～3×10-2毫克/毫升間羥叔丁腎上腺素（5-〔2-〔（1，1-二甲基乙基）氨基〕-1-羥乙基〕-1，3-二羥基苯）也能使纖毛細胞的交替運動加速，其作用與劑量有關(guān)，在加入5分鐘后作用尤為顯著，見圖3。
此外，實驗也證明在加入10-3毫克/毫升和3×10-3毫克/毫升乙酰膽堿后，纖毛細胞的交替運動也增加了。觀察到加入藥物10分鐘和5分鐘左右交替運動速度達到峰值，此時的藥物數(shù)量分別為10-3毫克/毫升和3×10毫克/毫升。在兩種場合下，交替運動在加藥后13分鐘即停止。
（評價）
實驗證明，間羥叔丁腎上腺素和乙酰膽堿（已知能促進纖毛擺動）也能促進纖毛細胞的交替運動。據(jù)認為纖毛細胞的交替運動會形成纖毛擺動從而有利于排痰。這清楚地表明N-乙酰神經(jīng)氨酸將會是有效的祛痰藥。
實施例5：
N-乙酰神經(jīng)氨酸對痰的影響
（目的）
用蛙腭粘膜測定粘膜纖毛的輸送速率（以下稱為MTR）即纖毛輸送痰的速率。同時，比較給予N-乙酰神經(jīng)氨酸前后痰的生理化學性質(zhì)。
（方法）
從慢性梗塞性肺病患者中采集12個樣品標本。將N-乙酰神經(jīng)氨酸加到痰標本內(nèi)，其比例為5毫克/毫升痰和1毫克/毫升痰。測定前標本于4℃下放置1小時。未加N-乙酰神經(jīng)氨酸的痰作為對照樣品。將蛙斷頭處死后，取出蛙頭腭粘膜，置于恒溫、恒濕條件下，直至它本身的粘液排干。將痰標本置于干燥的腭粘膜上，通過實體顯微鏡觀察痰的運動速度，從而側(cè)出其MTR。痰的PH值用電子HM-SAPPH計測定，而拉絲性是用Nagaoka和Yamanaka研制的裝置測量的（發(fā)表于1979年7月20日出版的第二次咳嗽和痰會議論文集中）。用Dulfano的雙管法測定塑變值（見Am.Rev.ofResp.Diseases.Vol.104，p88，1971）。
（結(jié)果）
如表4所示，6個樣品有5個用1毫克/毫升的N-乙酰神經(jīng)氨酸處理過，它們的PH值下降了，而未處理的1個樣品其PH稍有升高。高速到有3個樣品的塑變值增大，而其它三個則減少。至于拉絲性，5個樣品減弱，有1個稍微增強。拉絲性減弱的樣品。其MTR有增大的趨勢。
表4N-乙酰神經(jīng)氨酸對痰的影響
No處理表現(xiàn)數(shù)量PH塑變值拉絲性MTR
情況毫升毫米HO毫米毫米分
1B＊M27.723.75519
A＊＊7.3511.51938
2BM27.520.1108
A7.620.1319
3BM27.982.7520
A7.200.7227
4BM26.981.92225
A6.843.21229
5BM27.243.21818
A6.943.11630
5BM28.1614.32215
A7.887.52618
B＊：用N-乙酰神經(jīng)氨酸（2毫克）處理前
A＊＊：用N-乙酰神經(jīng)氨酸（2毫克）處理后
P：膿痰
M：粘痰
實施例6：
N-乙酰神經(jīng)氨酸的急性毒性實驗
經(jīng)靜脈、皮下注射和經(jīng)口吸入的方法實驗N-乙酰神經(jīng)氨酸對大鼠和小鼠的急性毒性。
（1）實驗動物
ICR小鼠6周齡
SD大鼠6周齡（在吸入實驗中用7周齡大鼠）
（2）藥物濃度13～15%（W/V）溶于蒸餾水中
（3）每個劑量水平的實驗動物數(shù)10
（4）觀察時間14日
（5）LD50的計算方法
用Litchfield-Wilcoxon法
實驗結(jié)果列于表5
表5LD50（毫克/公斤）
給藥途徑小鼠大鼠
MFMF
靜脈注射1700250018701880
（1441-2008）（2137-2925）（1748-2001）（1741-2030）
皮下注射＞5000＞5000＞5000＞5000
經(jīng)口吸入＞5000＞5000＞5000＞5000
--＞4.33克/米＞4.33克/米
吸入給藥是將實驗動物暴露于霧沫中1小時。
括號內(nèi)的數(shù)值為95%可信限。
實施例7：
N-乙酰神經(jīng)氨酸鈉鹽的合成
于N-乙酰神經(jīng)氨酸的水溶液中加入小量活性炭，于通痰下，加入1N的氫氧化鈉，調(diào)節(jié)其PH在7.3～7.8之間。然后用孔經(jīng)0.2微米的過濾器將反應(yīng)液過濾，濾液經(jīng)冷凍干燥，得N-乙酰神經(jīng)氨酸鈉鹽（為無色粉末）。
IRcm-13400，2937，1660～1620，1560。
分解點：約140～185℃（分解時成泡沫狀）
NMR1H-400MHz（D2O）
1.807（dd，Hax），2.205（dd，H3eg），4.022（m，H4），
3，901（t，H5），3973（d，H6），3，501（d，H7），3，747（m，H8），
3，831（dd，H9），3，598（dd，H9′），2，041（s，Ac-5）。
實施例8：
N-乙酰神經(jīng)氨酸鈉鹽對蛙腭粘膜纖毛運動的影響
用例7得到的N-乙酰神經(jīng)氨酸鈉鹽進行上述實驗。實驗方法和例1的相同。結(jié)果如表6所示。
從表6可見，N-乙酰神經(jīng)氨酸能加速蛙腭粘膜的MTR，作用強度和劑量有關(guān)。此結(jié)果與用乙酰膽堿（濃度為10-4，對照藥）所得的基本相同。這表明N-乙酰神經(jīng)氨酸鈉鹽產(chǎn)生與上述N-乙酰神經(jīng)氨酸及其鈣鹽相同的作用。
表6
N-乙酰神經(jīng)氨酸鈉鹽對粘膜纖毛輸送性能的影響
加速：平均值±標準偏差（%＊）
加速（%）＝（輸送速率（給藥組）/輸送速率（對照組）-1）×100
超過20.0%判定為顯著。
藥物加入數(shù)目N給藥后的時間，間隔（分）
（毫克/毫升）51015
對照-8-1.6±6.3-11.9±10.8-7.4±9.8
N-乙酰10-482.6±22.28.5±21.97.1±27.2
神經(jīng)氨酸10-316.2±19.518.9±22.117.7±34.0
鈉鹽10-220.8±25.518.0±29.75.7±24.9
10-110.7±19.28.5±23.47.4±24.7
乙酰膽堿10-483.0±7.63.8±15.5-5.5±10.0
10-312.3±8.519.9±16.813.9±20.5
10-217.5±14.318.8±21.124.9±25.6
10-122.8±26.131.0±24.930.5±19.5
實施例9：
N-乙酰神經(jīng)氨酸鈉鹽對纖毛細胞交替運動的影響
按例2所述的實驗方法，用N-乙酰神經(jīng)氨酸鈉鹽獨上述影響進行實驗。結(jié)果列于表7。它說明了下述事實。
當用10-3毫克/毫升N-乙酰神經(jīng)氨酸鈉鹽時，運動數(shù)目顯著增加。
間羥叔丁腎上腺素在10-3～10-2毫克/毫升之間交替運動有增強的趨勢。
乙酰膽堿在濃度為10-3～10-2毫克/毫升之間能使交替運動增強，其作用與劑量有關(guān)。
上述事實表明N-乙酰神經(jīng)氨酸鈉鹽可用作祛痰藥，其效果和N-乙酰神經(jīng)氨酸鈣鹽一樣有效。
表7
N-乙酰神經(jīng)氨酸鈉鹽對交替運動的纖毛輸送性能的影響
藥物劑量N灌注藥物后的時間間隔（分）
（毫克/毫升）51015
對照-81.0±5.8-0.9±6.8-1.9±6.8
間羥叔丁10-43-5.2±12.21.6±4.66.7±3.0
腎上腺素10-351.2±36.037.2±35.542.1±32.8
10-218.6±0.324.8±3.52.7±7.4
乙酰膽堿10-42-1.7±13.40.8±12.814.6±6.8
10-327.8±12.210.6±15.020.8±26.4
10-258.1±38.152.0±32.644.5±22.0
N-乙酰10-47-3.4±9.70.6±10.6-5.0±8.2
神經(jīng)氨酸10-311.6±29.820.7±27.516.2±32.2
鈉鹽10-21.5±11.62.1±18.23.7±29.3
10-10.0±5.84.7±6.615.4±9.3
加速（%）＝（周數(shù)（給藥組）/周數(shù)（對照組）-1）×100
A＞20.0為顯著。
實施例10：
N-乙酰神經(jīng)氨酸鈉鹽對痰的影響
按實施例5所述的實驗方法，實驗了N-乙酰神經(jīng)氨酸鈉鹽對痰的影響。結(jié)果如表8所示。
從表8可見，用N-乙酰神經(jīng)氨酸鈉鹽（1毫克/毫升痰）處理的樣品，其PH值和MTR明顯升高。雖然拉絲性總的有增強的現(xiàn)象，但塑變值卻減少了。
這些結(jié)果表明，N-乙酰神經(jīng)氨酸鈉鹽可用作祛痰藥，它能增大低粘性痰如膿性痰的粘度（這種痰不易排出），使它適于被纖毛輸送而便于排出。
表8
N-乙酰神經(jīng)氨酸給予前后對彌散性全細支氣管炎病人膿性痰流變學性質(zhì)的影響
處理標本數(shù)平均值±標準偏差
MTR（毫米/分）前159±5
后1512±5a
PH前157.48±0.41
后157.91±0.43b
塑變值毫米H2O前150.8±1.5
后150.3±0.6
拉絲性，毫米前1513±14
后1521±28
a：P＜0.01b：P＜0.001
實施例11：
N-乙酰神經(jīng)氨酸的急性毒性試驗
經(jīng)皮下、靜脈注射、腹腔注射和吸入等給藥途徑測定對小鼠、大鼠和豚鼠的急性毒性。
（1）實驗動物
ICR小鼠6周齡
SD大鼠6周齡
Hartley豚鼠6周齡
（2）每個劑量水平下的試驗動物數(shù)10
（3）藥物濃度20%（W/V），溶于蒸餾水中。
（4）觀察時間14天
（5）LD50的計算方法
用Probit法
結(jié)果列于表9
表9N-乙酰神經(jīng)氨酸鈉鹽的急性毒性
種屬LD50（毫克/公斤）
徑口給予皮下注射腹腔注射靜脈注射吸入
＞5000＞5000＞50006.286-
（5.679～
小鼠7.084）
＞5000＞5000＞50007.951-
（7.214～
9.073）
＞5000＞5000＞5000＞5000＞4.000毫克/米3
大鼠2.966
＞5000＞5000＞5000（2.638＞4.000毫克/米3
～3.342）
2.856
豚鼠（2.355～-
4.087）
吸入給藥是將實驗動物暴露于霧沫中1小時。
括號內(nèi)的數(shù)值表示95%可信限。