本發(fā)明與在測試樣品中檢測微生物存在的分析方法、試驗手段、所用的組分以及制備這些組分的方法有關。原則上，本發(fā)明適用于測定涉及有關保健領域內的細菌，如為了輔助診斷對人類排泄物或體液（即尿、血液、糞便）進行分析，或者用于檢測食品中的細菌污染。本發(fā)明能迅速、準確而又經濟地檢測特種細菌存在，因此在這些領域以及其它一些領域中具有重要的應用價值。

有許多檢測細菌存在并定其類型的方法。絕大多數方法是根據來自樣品材料中未知細菌的生長情況建立的。在選擇的培養(yǎng)基上使一種或多種細菌自身繁殖之后再進行分離并用顯微鏡觀察、生理學試驗，對抗生素的敏感性試驗、細菌對各種染色劑的攝入以及血清學分析等進行分型。許多生物學材料，如食物或皮膚，均含有很多類細菌。但大多數這樣的細菌就其試驗目的（如毒素產生，病原體等）來說，并不是試驗重點。因此，大多數試驗所使用的培養(yǎng)基盡可能是選擇培養(yǎng)基，它允許存在的欲被檢測的細菌生長，而盡可能多地阻止那些對試驗無用的細菌生長。這些加富培養(yǎng)基的例子很多，如用于培養(yǎng)腸道細菌的MacConkey培養(yǎng)基，以及用于培養(yǎng)厭氧生物的巰基醋酸鹽肉湯培養(yǎng)基。

根據細菌的本身特性按排的這些試驗進行是很慢的，因為在定與查對它對抗生素的敏感性之前，必須先分離出有關的生物體。這些步驟可能要花費多至幾天的時間，而對人或動物的細菌性疾病來說，這段時間可能是很關鍵的。

對微生物進行計數和定，以及檢驗它們對抗生素的敏感性是診斷醫(yī)學微生物學的主要任務。為了完成這些目的和任務，業(yè)已建立和發(fā)展了許多有關技術，試驗方法和培養(yǎng)基。然而，目前所應用的試驗中尚沒有一種能夠經短時間（如幾分鐘或幾小時）操作即可完成這些任務的。使用目前階段技術方法，對細菌進行總存活菌計數需要18-24小時。通過測定三磷酸腺苷（ATP）含量來估計微生物生物量試驗并不是特異性的，而且每毫升少于104-5個微生物的樣品就不能測定。對特異種屬細菌的計數通常需要選擇性培養(yǎng)基，并且要進行長時間的培養(yǎng)。對已分離到的菌落的最后定及對它們的抗生素敏感性檢驗常常需要在另一個生長周期進行并且需要附加試驗。因此，完成細菌的計數、定以及抗生素敏感性檢測的全過程正常情況下也需要幾天的時間。相反，現代醫(yī)學長期以來一直在尋找與目前可利用的十分冗長的操作程序不同的快速診斷方法，它能夠迅速檢測到和定出引起感染的細菌，并能在幾分或幾小時內獲取它們對不同抗生素敏感性的信息。

業(yè)已研究和發(fā)展了許多種其它技術，以試圖設計出能夠克服常規(guī)培養(yǎng)中許多缺點的新方法?？墒褂霉鈱W顯微鏡檢定臨床樣品中的細菌并可用以區(qū)分其間幾個主要的菌群。但這一技術并不能辨別死菌和活菌，而且檢定限度通常是在107細胞/毫升以上。已成功地發(fā)展了一些檢測特異性菌種和菌屬的免疫學方法，通過特異性抗體結合來區(qū)分細胞所具有的表面抗原，但這些方法需要有相對高濃度的細菌存在，并且還要有菌株特異性抗體。

所發(fā)展的其它方法包括基于檢測細菌代謝產物如檢測亞硝酸鹽核苷酸（如三磷酸腺苷）的，檢測從14C標記底物中釋放出的14CO2，以及特異性酶等。這些技術也有許多缺點，包括：ATP可被試驗樣品中的酶降解，ATP可由非細菌材料如寄主的組織產生生物公害中存在有放射活性物質，以及具有相似活性的酶亦能從寄主中產生等。

顆粒計數儀器也已被應用于檢測細菌。當電流穿過儀器中的小孔時，由于流經小孔的液體中存在顆粒，即引起測量儀器產生可記錄信號。此方法除須使用復雜而又貴重的裝置外，而且還是完全非特異的，需要精心使用，且要在無顆粒條件下進行。

其它一些類型的裝置則用于檢測特殊培養(yǎng)液中細菌的生長。用這些有關裝置進行周期性的比濁度測量，濁度增加即表明細菌存在著增長。這種方法也是非特異的，而且需要所測細菌高濃度（≥107細胞/毫升）地存在。

根據上述對常規(guī)微生物學方法的若干要求和限制的總結，長期以來人們都在尋找一種能夠迅速、靈敏、準確、而經濟地在所述環(huán)境中進行特異地定量檢測活細菌的技術和方法。盡管在密切相關的領域內的分析技術有了迅速進展，如放射免疫分析法、分光光度法、熒光測定法、微量量熱法電化學技術等的發(fā)展，但在細菌學試驗中所使用的主要技術仍保留了平板培養(yǎng)法。當今的這一技術仍然包括許多由巴斯德和20世紀初期的其它微生物學家所使用的同樣材料和方法。

在生物學系統(tǒng)中，遺傳重組一般不在生物種間發(fā)生。然而，新的重組DNA技術方法現已可以使基因在相關和不相關生物體之間轉移。由基因總構引起的遺傳性的改變的可能性在工業(yè)和醫(yī)學微生物領域中具有特殊的應用價值?，F在已能在體外從各種真核生物或原核生物來源中收集到貯存在DNA片段上的不同遺傳信息。并且引入到能自我復制的遺傳載體，即所謂克隆運載體中。另外，DNA片段，或整個基因也能用化學方法，按照理論上所期望的或已知序列進行合成，然后把它引入到一個選擇好的運載體上。細菌質?；蚴删w是常用的克隆運載體。質粒是一種存在于染色體外的獨立遺傳單位，由環(huán)形DNA鏈構成，可在大多數細菌和某些真核細胞中找到。噬菌體是DNA病毒，只寄生于細菌。雜交的遺傳運載體則能被引入到經選擇過的微生物寄主中，而微生物寄主本身則能作為有潛在能力的大量生產克隆化DNA的工廠。

經過轉化的微生物常常并不能表達存在于克隆載體中的外源遺傳信息。在外源基因組產生一種對寄主生物體有害的產物的那些前提下，這樣的不表達的克隆運載體才有希望可被應用不表達的或低表達的克隆運載體是供獻外源基因的備用來源，因為它也能被分離出來，也能引入到合適的表達載體中（即一種特行制備的或經過選擇的質粒）應用已知的技術，將外源DNA安置在表達運載體的適當部位上，該部位的原有遺傳序列能使外源遺傳信息被轉錄（即從外源DNA轉錄出mRNA）和轉譯（即以轉錄出的mRNA為模板合成蛋白質），從而可得到外源DNA所編碼的予期產物。通過轉化使含有這種表達載體的微生物將作為制造外源DNA產物的工廠。

DNA可在體外用一類稱為限制性內切酶的酶類在特定的部位被切斷，以便準備將其插入一個適當的轉移載體中。限制性內切酶是位點特異性內切酶類，主要是裂解雙鏈DNA，但在有些情況中可裂解單鏈DNA。例如，Ⅱ類限制性內切酶是在特定序列上切斷DNA。相反，第Ⅰ類限制性內切酶則是隨機地切斷DNA并產生不均-產物。各種限制性內切酶酶介產生出不同長度和類型的DNA片段。例如，有些限制性內切酶在兩條鏈同一位點切斷DNA產生所謂的“平頭”DNA片段。反之，另一些限制性內切酶則在離開互補鏈切點幾個核苷處切斷另一條DNA鏈并得到“粘性末端”DNA片段。因此，一個有造詣的重組DNA工藝的實際工作人員，通過創(chuàng)造性的選擇處理主體DNA的內切酶，可以獲得予期的DNA片段，之后在DNA連接酶的作用下將其連接起來。為了達到連接的目的，在被切斷的DNA片段末端加上若干個核苷酸，并且將互補的脫氧核糖核苷酸加到克隆載體的兩端（即使用所謂同型多聚物尾接法）。為得到要求的DNA融合產物而采用的另一個通用方法，是在克隆運載體或欲被克隆的DNA片段的一端或兩端加上“接合體”或“接頭片段”。接頭片段是小段DNA，含有一個或多個限制性內切酶的識別序列。這樣，含有遺傳信息之DNA片段的酶切和拼接已告完成。已被克隆的并且插入寄主微生物體內的外源DNA片段的準確序列可用序列分析方法測定。

用于插入轉移運載體的外源DNA片段可用幾種方法得到。例如可由親代DNA直接得到能被插入適當載體的DNA片段。另一種方法是從親代系統(tǒng)中合成活躍部位中得到mRNA，之后用酶（反轉錄酶）合成與分離的mRNA互補DNA單鏈。再以此單鏈為模板合成雙鏈DNA分子。以這種方式得到的雙鏈DNA即為互補DNA（cDNA）。

一旦所期望的DNA序列成為已知，則用于體外克隆的基因，用在微生物中，生物組織中或細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中表達的基因也都能被化學合成。

由于重組DNA技術的出現，近年來在分子生物學領域內已取得了激動人心的進展。其中有些工作是針對診斷試驗的。例如在人類胚胎時期便能檢測許多遺傳性疾病，甚至在沒有顯示出疾病本身未發(fā)現的疾病在親代中的攜帶者，也可通過使用限制性內切酶和核酸雜交技術檢測出來。用DNA或RNA特異性探針以及核酸雜交技術查明已知類型細菌之存在的研究也正在發(fā)展。然而，使用新穎的遺傳構建方法，特別是用人工手段（體外的）進行部分或全部檢測特殊生物體的技術尚未見報導，而這便是本發(fā)明的基礎。本發(fā)明的較好技術環(huán)節(jié)是使用費希爾弧菌的發(fā)光系統(tǒng)。由我們發(fā)展的這一技術決不被限制在那個系統(tǒng)。凡在寄主細菌中表現表達明顯增加從而確定該細菌是否存在的任何外源基因-引入系統(tǒng)也都能被應用。

涉及生物發(fā)光和化學發(fā)光的出版物很多〔參見（P.J.Herrig的“生物發(fā)光在運轉中”（“BioluminescenceinAction”），Academic出版社，紐約，NY1978;（M.A.deLucaW.D.McElroy的“生物發(fā)光和化學發(fā)光”（BioluminescenceandChemiluminescence”），Academic出版社、紐約，NY1981）。有關磷光和化學發(fā)光的美國專利有3958938號，3470373號，3567581號，3959081號，3567586號和4144134號。

論述遺傳工程各個方面，特別是涉及重組DNA的文獻數量迅速增加。已公開的涉及運載體、重組構成物、方法學以及新的微生物等領域的專利也很多，如美國專利4082613號，4184917號，4190495號，4195125號，4237224號，4468464號，4259444號，4262090號，4262731號，4273874號，4259444號，4262090號，4262731號，4273874號，4321365號，4399216號，4340674號，4506013號，4503151號和4504584號。3930956號專利包括將未加工的細菌DNA轉移到營養(yǎng)缺陷型中的內容。美國專利4104126號中則描述了噬菌體誘發(fā)細菌裂介的檢測方法。

1983年，Engebrecht等人（J.恩格伯萊茨，K.涅爾松和M.西爾沃曼，1983，細菌的生物發(fā)光：由費希爾弧菌中分離及功能的遺傳學分析，細胞32，773-781）描述了費希爾弧菌（MJ-1）DNA的BamHI酶切片段與質粒PACYC184連接而構建的各種重組質粒。這些重組質粒引入到大腸桿菌中，并使其在該菌中表達且與在費希爾弧菌中產生差不多水平的發(fā)光。其它涉及細菌發(fā)光的出版物包括：伯拉斯，R.等人的報告〔科學218，791-3（1982）〕;依萬斯，J.E.等人“在大腸桿菌系統(tǒng)中體外合成細菌熒光素酶的亞單位”〔細菌學雜志，153：543-545（1983）〕;以及恩格伯萊茨，J和M.西爾沃曼的“細菌生物發(fā)光所必需的基因和基因產物定”。（“Identificationofgehesandgeneproduotsnecessaryforbacterialbioluminescence”）〔美國國家科學院會議錄（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）81;4154-4158（1984）〕;J.恩格伯萊茨等人的“用光檢測基因表達”〔科學227：1345-47（1985）〕。不包括熒光素酶的發(fā)光系統(tǒng)是已知的〔P.德索爾（Desole，P.）等人，臨床實驗室自動裝置（Clin.Lab.Automation）3：391-400（1983）〕。在這些出版物中均沒有提到使用本技術以檢測細菌。據本發(fā)明人的全面了解，在任何其它出版物中也都沒有使用發(fā)光的基因以檢測細菌或其他微生物。

本發(fā)明的一個目的是提供一種特異地定細菌的快速試驗方法。發(fā)明的另一個目的是提供一種能夠檢測和定低濃度細菌的高度靈敏的測試方法。發(fā)明的再一個目的是提供一種能夠對被檢測細菌進行定量的試驗方法。本發(fā)明還有一個目的是提供一種檢測細菌對抗生素敏感性的試驗方法。本發(fā)明的這些和另一些目的將在以下的描述中會使人明白的，特別會在附加的權利要求書中加以闡明。

多種植物和動物均表現有生物學上的化學發(fā)光作用?；瘜W發(fā)光也在微生物中發(fā)現?！布茨承┘毦ㄖ饕敲干?，如費希爾弧菌）、真菌和雙鞭甲藻〕昆蟲（如熒火蟲，PhotinusPyradis）、某些甲殼網動物（即Cypridinehilgenderfi）、海蜇（水母）、蠕蟲以及其它無脊椎動物，甚至哺乳動物。雖然發(fā)光的生物化學機制已知是各不相同的（即細菌中所見的發(fā)光系統(tǒng)不同于在熒火蟲和雙鞭甲藻所見的發(fā)光系統(tǒng)），但活生物體中光的產生大多是由熒光素酶催化的。細菌的熒光素酶是一種混合功能性氧化酶，含有兩個不同的亞單位，各具有大約40000道爾頓的分子量。

在細菌費希爾弧菌中，參與發(fā)光系統(tǒng)的酶的合成是受一種小的傳感分子即自體誘導物（autoinducer）調節(jié)的。細菌生長期間，自體誘導物在生長培養(yǎng)基中積聚，當自體誘導物的濃度達到一個閾值時，即誘發(fā)發(fā)光系統(tǒng)，導致成千倍增加光的產生。

新試驗方法的較好元件是帶有發(fā)光菌之（通常是酶生菌，如費希爾弧菌）發(fā)光系統(tǒng)的DNA片段。

當然，一個帶有發(fā)光基因的細胞外DNA片段是不能發(fā)光的，但是如通過轉導和轉化的方法將其轉移到一種適宜的活的寄主體內，該寄主的遺傳和合成機器即可利用這個DNA片段而產生可發(fā)射的光。細胞內基因片段如果在被試生物體中表達很差或不被表達，并且只有當外源DNA經某些遺傳學方法轉移到要檢測其存在或不存在的生物體中后，才能成為被表達條件時，則亦可使用這種細胞內基因片段。后一種方法可使用接合方法，即交配和由一個細胞向另一個細胞的基因轉移。

通過噬菌體感染（轉導）、轉化或接合技術將DNA引入細菌細胞內，通常是受供體源的限制的：即DNA轉移發(fā)生在同一個種的菌株群之間或者親緣關系密切的種間。有些因子也會限制這種轉移，這包括存在于許多菌種和/或其菌株之中的DNA修飾限制系統(tǒng)，也依賴于影響引入DNA的復制的寄主因子和細菌細胞壁上的噬菌體適當受體，噬菌體通過這些受體吸附于寄主細胞上并將其遺傳物質注入寄主內。

接合和轉化并沒有很嚴格的菌株特異性。有些質粒通過接合不僅可以轉移到同種寄主之中，它可轉移到相近種寄主中。甚至有幾種質粒可通過接合被轉移到親緣較遠種的寄主內。轉化作用甚至比接合更廣的應用潛力，因為相當范圍內的許多細菌能感受細胞外DNA。事實上，有許多細菌（如果不是大多數）可能在特殊條件下是可被轉化的，但目前尚不知道如何做到，例如，大腸桿菌在正常情況下并不能有效地感受DNA，但在鈣休克之后，這種細菌即可被誘發(fā)以高效率感受以外DNA。在應用轉化方法中，一個限制因素是外源DNA的表達、復制或其遺傳信息整合到寄主基因組中去的能力。

與轉化和接合不同，轉導則是有很高的菌株或菌種特異性的。某些噬菌感染一些菌種通常是關系很近的細菌;大多數則只感染一個單一種菌株的特殊子菌株。通過使用不同種類的噬菌體品系去感染細菌的品系，可能將一個菌種的不同菌株排列成分類表，這便是所謂的噬菌體分型

重組DNA技術和分子遺傳學允許那些產物很容易進行分析的基因引入，因而，如將大腸桿菌的laoZ基因引入，即可導致被引入基因的表達，例如，用一種噬菌體去引入該基因，然后即可通過分析β-半乳糖苷酶形成的量測知噬菌體接著發(fā)生的感染過程。即使細菌細胞本身可能具有這種酶的基因，但也可進行這些測定-這是因為其內源水平可受到適當介質的抑制，而噬菌體遺傳物質的擴增導致產生基因的眾多拷貝。

本發(fā)明中雖然也有許多外源性遺傳系統(tǒng)可被利用，但特別有用的還是費希爾弧菌的發(fā)光系統(tǒng)，并以其闡明我們的判定已知菌種是否存在的方法。只有少數幾個菌種含有能將化學能轉化為光能的基因，而其中的大多數又是酶生菌。絕大多數的菌種不含有這樣的系統(tǒng)并且是不發(fā)光的。如果將產生光的基因引入一種不具有這種能力的細菌并使其在其中表達，那這種細菌將也能發(fā)射光。在這樣的系統(tǒng)中的本底干擾是極低的（化學發(fā)光）。因為可檢測到很低水平的光，所以基于這種方法的試驗是很靈敏的和可定量的。

依據本發(fā)明，我們提供了檢測環(huán)境中細菌特異類型和細菌組群的方法和組分，其中從合適的供體生物得到含有發(fā)光系統(tǒng)或其它遺傳系統(tǒng)的外源DNA，通過轉化、轉導或接合等遺傳學手段，轉移到沒有或含有相當低水平內源性DNA的寄主菌內。供體遺傳物質進入待檢測的生物體中，導致被引入系統(tǒng)的表達。這樣的引入基因在待測生物中的表達，就可以檢測其存在與數量。另外，如果引入時加進抗生素，還可檢測寄主生物體對抗生素的敏感性。本發(fā)明的一個較好方法包括將得自發(fā)光菌（或其它來源）的發(fā)光系統(tǒng)或其一部分轉移到非發(fā)光寄主微生物內，接著在該寄主中表達熒光素酶或其它系統(tǒng)并伴隨產生光或其它標記。本發(fā)明亦可用以檢測試樣中的抗生素，分析微生物對抗生素的敏感性，或者分析抗生素活性組分等。

另外，本方法亦可使用于任何在其進入欲被檢測存在或不存在的這種細菌之前，細菌對之不能表達或表達很弱（差）的其它遺傳系統(tǒng)。例如，引入編碼酶或蛋白質（如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶或雞的卵白蛋白）的基因，可通過酶學分析，或者也可使用免疫分析法監(jiān)測其表達水平，這些測定手段可以是基于pH改變或H+以外的離子濃度改變;或者特定分子的產生（如氨基酸、堿基、脂等）或特定分子的降解或消失;氣體（如大腸桿菌產生的H2）的產生;顏色的形成或消失（如堿性磷酸酶催化對位硝基苯酚磷酸酯成為對位硝基苯酚）或者在給定波段具有特殊光吸收特性的分子或放射活性標記的分子的形成或消失，依賴于初級產物的次生分子的產生或消失等等。

發(fā)光細菌主要是酶生菌，典型的就是費希爾弧菌。含有發(fā)光系統(tǒng)的DNA來自發(fā)光細菌，熒火蟲、雙鞭甲藻或發(fā)光真菌類，可能是天然存在，在這里它們則都是來自其發(fā)光器官。另外，來自發(fā)光細菌或其他來源的含有發(fā)光系統(tǒng)的DNA或其部分DNA也可以用發(fā)光系統(tǒng)或來自發(fā)光來源的部分進行人工重組或合成。

在有細菌發(fā)光系統(tǒng)參予情況下，可望在培養(yǎng)基中會含一定量發(fā)光菌的自體誘導物，從中衍生出發(fā)光系統(tǒng)或其一部分，以便避免在寄主生物體內為形成自體誘導物所需要的長時間培養(yǎng)過程。如需要時，也可以向培養(yǎng)環(huán)境中加入一種脂族醛，以加速和提高來自發(fā)光細菌的發(fā)光系統(tǒng)或其部分的表達。在這些例子中，可將發(fā)光系統(tǒng)以外的外源遺傳標記物系統(tǒng)引入到適用的寄主中，這樣也許有利于引入中間體、前體、酶底物或其它成分，以加速或提高標記物遺傳系統(tǒng)的表達或表達的檢測。

在寄主生物體中，含有得自發(fā)光菌或其它來源的發(fā)光系統(tǒng)或發(fā)光系統(tǒng)一部分的DNA，通過RNA聚合酶的作用被轉錄成mRNA，之后mRNA被翻譯成發(fā)光系統(tǒng)蛋白質。借助于閃爍計數器甚至可檢測到單個細菌的光發(fā)射。

從而可以看出，依據本發(fā)明，由兩個非發(fā)光部分之間相互作用而產生發(fā)光：即被檢測的生物體和上述含有來自發(fā)光細菌或其它來源之發(fā)光系統(tǒng)或發(fā)光系統(tǒng)一部分的DNA之間的相互作用，而產生發(fā)光。因此，根據任何顯示出超過本底的化學發(fā)光，便可確定有寄主微生物存在;相反地，如果沒有超出本底水平的化學發(fā)光，則可證明不存在寄主微生物。這樣一種技術是以前從未提出過的。

依據本發(fā)明，有可能作出標準曲線以顯示它們的關系，例如可畫出發(fā)光水平或其它表達系統(tǒng)水平與所檢測的細菌濃度之間相互關系的標準曲線。使用這一曲線，可大致估計出環(huán)境中細菌的量。

通過轉化、轉導或接合的傳遞，可將含有來自適當供體的發(fā)光或其它標志物系統(tǒng)的DNA轉移到寄主生物體中。有許多微生物種屬可作為噬菌體的寄主以及保留或接受質粒。這樣的菌屬的例子有：挨希氏桿菌屬、氣桿菌屬、沙門氏桿菌屬、志賀氏桿菌屬、克雷伯氏菌屬、變形桿菌屬、假單胞菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、衣原體屬、枝原體屬、肺炎球菌屬、奈瑟氏菌屬、梭菌屬、芽孢桿菌屬、棒狀桿菌屬、分枝桿菌屬、Camphybacter、弧菌屬、沙雷氏菌屬、腸桿菌屬、普羅威登斯菌屬、色素桿菌屬、布魯氏菌屬、耶爾森氏菌屬、嗜血桿菌屬以及博德特氏桿菌屬。

為特異而收集的噬菌體應對被檢測的細菌是特異的。如需要時，可用不同的噬菌體進行一系列試驗，這些實驗既可連續(xù)進行也可以同時進行。

有些噬菌體可通過包裝DNA來構建，把含有得自發(fā)光細菌或其它適當生物來源的發(fā)光系統(tǒng)，或發(fā)光系統(tǒng)一部分或其他供體標記系統(tǒng)的DNA與合適的噬菌體衣殼進行包裝構建。另外噬菌體亦可用限制性內切酶通過重組DNA技術再用包裝或不包裝進行構建。再者，也可通過自然發(fā)生的遺傳重組機制構建含有全部或部分發(fā)光或其它系統(tǒng)的噬菌體。這一技術也包括了使用人工重組和自然重組。

為了接合，本發(fā)明提供了可在轉移復制子中含有發(fā)光系統(tǒng)或發(fā)光系統(tǒng)一部分的細菌菌株。復制子可以是細菌染色體的或質粒的。可通過噬菌體或遺傳重組（自然的或人工的）將發(fā)光系統(tǒng)或發(fā)光系統(tǒng)一部分引入，這樣發(fā)光基因即可共價結合于轉移的遺傳物質上。另外，任任何其他遺傳系統(tǒng)，其初級和次生產物如早期所述那樣可被測定，那末也可以用同樣方式進行。為了說明起見，拿發(fā)光作為切合而又特殊的例子闡述本發(fā)明比較一般的原則基礎。

例如，依據本發(fā)明的接合，可使用Hfr（高頻率接合）的細菌菌株，它是帶有發(fā)光系統(tǒng)的溫和噬菌體的溶源菌株。顯然另一類Hfr株或供體株也可通過遺傳重組天然的或人工的或通過加入遺傳物質得到使得Hfr菌株或供體株帶有發(fā)光系統(tǒng)或發(fā)光系統(tǒng)一部分。

在完成根據本發(fā)明所敘述的試驗中，寄主生物體所進行的代謝活動涉及發(fā)光或其它供體系統(tǒng)的形成;這包括蛋白質合成和產生還原能力的過程。影響這些過程或改變細胞完整性的抗微生物試劑能取消或降低供體遺傳系統(tǒng)（即發(fā)光等）的形成。因此根據本發(fā)明可能測定細菌對各種抗菌試劑如抗生素的敏感性。為此，在給定的抗菌劑存在下，受到DNA轉移之被試細菌的特殊類型和類群，以及被表述之供體遺傳系統(tǒng)（即發(fā)光）的動力學-是寄主細菌的蛋白質合成能力和總代謝的函數，都能被檢定。最好同時進行試驗，即一種細菌是處于沒有任何抗菌劑的條件下，而其它的幾種細菌每種都處于有特殊抗菌劑的條件下，通過比較這些試驗的結果，即可得到被試細菌對各種抗菌劑之敏感性的結論。

特殊試驗方法的描述

1、材料和方法

Ⅰ、生長培養(yǎng)基

A、LB（Lennox肉湯培養(yǎng)基）。（Lennox，E.S.1955，“通過噬菌體轉導寄主聯(lián)鎖的遺傳性狀”，Pl.Virologyl：190-206）?！?0克胰蛋白胨;5克NaCl：5g酵母提取物;1升蒸餾水;4毫升1NNaOH〕。

1、培養(yǎng)皿：加入瓊脂15克/升。

2、于121℃蒸汽高壓滅菌15分鐘。

3、按說明加入：（a）氨芐青霉素30毫克/升;（b）氯霉素30毫克/升;（c）四環(huán)素15毫克/升。

B、FT〔10克胰蛋白胨;5克NaOH;2克麥芽糖;10毫升1摩爾MgSO4;1升蒸餾水〕

1、于121℃蒸汽高壓滅菌15分鐘。

2、按說明須加入：（a）氨芐青霉素30毫克/升;（b）氯霉素30毫克/升;（c）四環(huán)素15毫克/升。

C、用于噬菌體的T〔10克胰蛋白胨;5克NaCl;10瓊脂;1升H2O〕

1、于121℃蒸汽高壓滅菌15分鐘。

D、TA（TopAgar）〔10克胰蛋白胨;5克NaCl;6.5克瓊脂;1升H2O〕

1、于121℃蒸汽高壓滅菌15分鐘。

E、復合液體培養(yǎng)基（ASMRP）和復合固體培養(yǎng)基按Ulitzur等人所述的方法制備（Ulitzur，S.，Weiser，I.和S.Yannai1980：“一種用于測定誘變化合物的新的、靈敏的和簡單的生物發(fā)光試驗”，MutationRes.74：113-124）。

Ⅱ、菌株和DNA

A、細菌菌株

1、MM294大腸桿菌K12ehdAthiProhsdR（Backman，K.，Ptashne，M.和W.Gilbert，1976：帶有噬菌體之cI基因的質粒的構建。Proc.Natl.Acad.Sci.USA73：4174-4178）。

2、JM101大腸桿菌K12endAthiSbsBSuplac-pro/F′traDProABIacIIacz△M15（Vieira，J.和J.Messing，1982：“PUS質粒，一種用于插入誘變和序列分析以及帶有合成的通用引物的M13mp7衍生系統(tǒng)”，Gene19：259-268）。

3、W3110大腸桿菌K12F-野生型（Yanofsky，CHorn，V.，Bonner，M.和S.Stasiowski，1971：“大腸桿菌色氨酸操縱子之前三個基因在突變體中的極性和酶功能”，Genefics69：409-433）。

4、AT2448大腸桿菌K12HfrHthimet。

5、CSHI大腸桿菌K12lactrpsbrA（Miller，J.H.1972：分子遺傳學實驗。冷春港實驗室，ColdSpringHarbor，N.Y.）。

6、普通變形桿菌。

7、白色葡萄球菌。

8、產氣氣桿菌62-1（Gibson，F.，1968：分支酸，94-79頁，W.E.M.Lands編輯的“生物化學制備”，12卷，JohnWiley父子出版公司，紐約）。

B、噬菌體株

1、入cI+野生型。

2、入卡龍30（Maniatis，T.，Fritsch，E.F.和J.Sambrook，1982：冷泉港實驗室，ColdSpringHarbor，N.Y）。

2、入cI1857S7（Miller，J.H.，1972：分子遺傳學實驗。冷泉港實驗室，ColdSpringHarbor，N.Y.）。

4、λcI-b2。

5、λcIS57S7plac5（Miller，OP.Cit.）。

C、質粒和DNA

1、PBR，3224.364堿基，含有氨芐青霉素和四環(huán)素抗性基因（Bolivar，F.，Rodriguez，R.L.，Greene，P.L.，Betlach，M.C.，Heynecker.H.L.，Boyer，H.W.，Crosa，J.H.和Falkow，S.，1977：新的克隆載體的構建和鑒定。Ⅱ，多用途的克隆系統(tǒng)。Gene2：95-113）。轉化后，這些抗生有利于檢測質?；蚱渲亟M體的存在。

2、4.3堿基的PACYC184A質粒，含有對四環(huán)素和氯霉素抗性基因（Chang，A.C.Y.，和Cohen，S.N.，1978：自P15A隱性微小質粒衍生來的可放大的多拷貝DNA克隆運載體的構建和鑒定，J.Bacteriol.134：1141-1156）。

Ⅲ、噬菌體技術

主要使用Miller（loccit.）所介紹的技術，所不同只是所用平板培養(yǎng)基為T，液體培養(yǎng)基為FT。

Ⅳ、細菌DNA的制備應用Marmur的方法（Marmur，J.1961：從微生物中分離脫氧核糖核酸的方法。J.MolecBiol.3：208-218）。

Ⅴ、限制性內切酶的使用和來源

限制性內切酶購自BRL，NewEnglandBiolabs，Boehringer和Amersham。按照NewEnglandBiolabs公司產品說明書介紹的方法用這些酶降解DNA，不同的只是在所有各例中均以100微克/毫升白明膠代替牛血清白蛋白。DNA濃度不超過2微克/20微升。

A、瓊脂糖凝膠

1、2克瓊脂糖（Sigma商品目錄A6013號）。

2、200毫升TAE緩沖液（LX）;TAE緩沖液10X：

（a）484克Sigma7-9Tris（羥甲基氨基甲烷）商品目錄TI379號（TrisHCl）;

（b）27.2克醋酸鈉;（c）10.5克NaCl;

（d）7.5克乙二胺四乙酸二鈉;（e）17毫升濃鹽酸;（f）925毫升蒸餾水;（g）pH8.2（25℃）;

（?。┫蚋鱀NA樣品（1-20升）中加入溶于甘油的4微升溴酚蘭。

（ⅱ）凝膠電泳在緩沖液40-250毫安培電流中進行直到染料泳動-適當距離后停止。

3、必要時，用限制性內切酶HindⅢ或EcoRI將λcI857S7DNA酶介，用作分子大小的參照標準使用。應用回歸分析法確定分子長度的log值與泳動距離之間的關系。當相關系數大于r＝0.99時，這個標準則被認為是可接受的。

4、將凝膠放在塑料盤中，用足夠的水復蓋以進行染色。加入七滴濃度為10毫克/毫升的溴化乙錠（SigmaE8751），并將盤子輕輕傾斜使之擴散。15分鐘后吸去過多的染料，用水沖洗凝膠后用無染料的水再復蓋之。15分鐘后除去水，將凝膠放在長波長紫外光盒上即可看到DNA條帶。用柯達TriX膠片照相。

Ⅵ、連接

加入十分之一體積的3N乙酸鈉和2.2體積的經重蒸餾過的96%乙醇沉淀經限制性內切酶酶介的DNA。于-70℃冷凍后放在干冰-乙醇浴中用Eppendorf離心機在Eppendorf管中離心10分鐘，小心除掉并棄去上清液，用100微升70%乙醇洗沉淀團塊，離心3分鐘，去除并棄去上清，用真空在干燥器中將沉淀團塊抽干，再將團塊再懸浮于水中。連接反應在20μl內含4微升5倍濃縮的激酶-接頭緩沖液（Maniatis等人，loc.cit.）和1微升DNA連接酶（NewEnglandBilabs產品，產品目錄202號，400單位/毫升）中進行，于25℃保溫12-16小時。DNA濃度通常為0.5-1.0微克/20微升反應液。

Ⅶ、質粒DNA的制備

A、小體積制備粗制質粒DNA。

1、將含有質粒的菌株在含抗生素的LB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)過夜，因質粒賦于細菌對該抗生素的抗性，故只有帶有這種特定質粒的細菌才能增殖。

2、取1毫升細胞懸液，在Eppendorf離心機中離心20秒。

3、棄去上清并將沉淀團塊再懸浮于50微升STET緩沖液（8%蔗糖，5%Triton-100，50毫摩爾二乙胺四乙酸二鈉，50毫摩爾（羥甲基氨基甲烷）-HCl，PH8.0）。

4、加入4微升濃度為10毫克/毫升的溶菌酶（Sigma產品，目錄號L6876）。

5、將懸液在沸水中沉浸40秒鐘。

6、立刻將懸液在Eppendorf離心機（5412型）中離心20分鐘。

7、將上清小心移入另一離心管中，棄去沉淀團塊。

8、加50微升異丙醇，混合離心管內容物，置于乙醇-干冰浴中，-70℃放置10分鐘。

9、在Eppendorf離心機中離心10分鐘。

10、除去上清。于真空下將沉淀團塊抽干10分鐘。

11、將沉淀團塊重新懸浮于50微升0.3摩爾乙酸鈉溶液中。

12、加150微升重蒸乙醇，混合離心管內容物，并在乙醇-干冰浴中-70℃放置10分鐘。

13、離心10分鐘，小心傾去上清。

14、加200微升冷（-20℃）70%乙醇沖洗沉淀團塊，但不攪散團塊。

15、離心2分鐘，傾去上清，于真空下抽干沉淀團塊。

16、加20微升H2O使沉淀團塊重新懸浮。

17、對于大多數質粒，約可回收1微克相當純的質粒DNA。

B、用氯化銫-溴化乙錠平衡密度梯度離心方法制備高度純化的質粒DNA。

1、將1升培養(yǎng)物在含有適當抗生素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-16小時，以使只含特殊質粒的細菌生長。

2、把培養(yǎng)物放在四個250毫升離心杯中于0℃冷卻并以5000×g離心10分鐘。棄去上清。

3、用20毫升含1毫摩爾二乙胺四乙酸（EDTA）的25毫摩爾Tris-HCl緩沖液（pH7.9）洗沉淀團塊。

4、再將各沉淀團塊懸浮于7.5毫升在50毫摩爾Tris-HCl（PH8.0）中配制成的25%蔗糖液中，并將各份重新懸浮的沉淀團塊轉移入40毫升聚丙烯管（OakRidge型）中。

5、加15毫升溶菌酶（Sigma產品，產品目錄號L6876）該溶菌酶在0.25摩爾Tris-HCl（PH8.0）中以5毫克/毫升濃度臨用時配制，混合并于0℃保持5分鐘。

6、加3毫升0.25摩爾NaEDTA（PH8.0），混合并于0℃保持5分鐘。

7、加溫至室溫并加1毫升十二烷基磺酸鈉（SDS）溶液（在50毫摩爾Tris-HCl中制成12.5%，PH8.0）。用輕輕倒置混合之并放置15分鐘。

8、冷卻至0℃并加25毫升5摩爾NaCl。用輕輕倒置混合之并于0℃放置30分鐘。

9、于-4℃，以43，000g（SorvallSS-34轉頭19，000轉/分）離心45分鐘。

10、將四份上清（各約12毫升）輕輕倒入四個40毫升的聚丙烯管中，棄去沉淀團塊，用等體積水稀釋。

11、RNA酶在T1緩沖液中于80℃加熱20分鐘使任何DNA酶失活后，在各管加50微升（10毫克/毫升，Sigma產品，產品目錄號R5503）。T1緩沖液：10毫摩爾MgSO4，0.5毫摩爾CaCl2，0.1%白明膠，6毫摩爾Tris-HCl，PH8.0。于37℃留存1小時。

12、冷卻并加4毫升用STE緩沖液飽和的苯酚。STE緩沖液：10毫摩爾Tris-HCl（PH7.9），10毫摩爾NaCl，1毫摩爾EDTA。充分混合并于0℃以16000g離心15分鐘。

13、從各管中小心把上層（液相），傾入一個250毫升離心并中。加四分之一體積的5毫摩爾NaCl并混合之。加入兩倍（總）體積量的乙醇并混和之。于-20℃放置至少12小時。

14、以9，000轉/分離心45分鐘。棄去上清。加50毫升70%乙醇并輕輕洗沉淀團塊。以9，000轉/分離心20分鐘。移除并棄去上清。于真空下將沉淀團塊干燥15分鐘，重新懸浮于5毫升STE緩沖液中。

15、加STE使含DNA溶液達到46.2毫升。加45克氯化銫，再加1.8毫升溶于STE緩沖液的濃度為10毫克/毫升的溴化乙錠（Sigma產品，產品目錄號E8751）溶液。調整溶液，使其折光率rD在1.3870-1.3880之間（ρ＝1.565-1.576）。

16、向6個3×5/8英吋的同質異晶聚合物管內各吸移10毫升混合物，試管加帽并以石臘油充填，用Ti50轉頭以38，000轉/分于15℃離心48小時。

17、使用1英寸20號針頭和3毫升注射器吸出較低的帶（用紫外光燈觀察）。用等體積異丙醇抽提溴化乙錠四次（儲備品保存用CsCl飽和的STE緩沖液）。

18、用4體積水稀釋分離的水溶液再加2倍總體積的乙醇（96%），于-20℃保存12小時。于40毫升聚丙烯管中于-4℃以19，000轉/分離心1小時。丟棄上清。將沉淀物傾出于真空下干燥15分鐘。將DNA提取物重新懸浮于1毫升STE緩沖液中。

Ⅷ、轉化（參照M.Mandel和A.Higa，1970：依賴鈣的噬菌體DNA感染，J.Molec、Biol，53：159-162）。

將欲作轉化的細菌菌株于37℃在LB培養(yǎng)基中生長過夜。以1：200稀釋度加入新鮮LB培養(yǎng)液，于37℃通氣培養(yǎng)，直到其于600毫微米的吸光率（A）為0.5。在冰浴中冷卻培養(yǎng)物（原始體積），之后用Backman離心機（JA20轉頭）于0℃以7000轉/分離心7分鐘。將細胞重新懸浮于同體積冰冷的0.1摩爾MgCl2中，并按上述條件再次離心。將細胞沉淀物再重新懸浮于原體積一半的0.1摩爾CaCl2中并于冰浴中放置30分鐘。如前一樣離心該懸浮并再次懸浮于原體積十分之一體積的0.1摩爾CaCl2中。這些細胞就是轉化感受態(tài)細胞。

取0.2毫升經濃縮并經CaCl2處理過的細胞與1-100微升含0.1-2微克DNA的溶液混合?；旌衔镉?℃放置30分鐘，在42℃水浴中加熱3分鐘并再次在冰浴中放置20分鐘。之后加0.8毫升LB培養(yǎng)基并將培養(yǎng)物于37℃放置1小時，因為細胞正在從經鈣休克中恢復過來，故可允許基本上沒有細胞分裂的情況下表達抗生素抗性。將培養(yǎng)物分成幾部分加于LB平板（含適當抗生素）上。對照組包括未轉化的但經Ca++處理的細胞以及用已知量未酶解的質粒轉化的細胞。

Ⅸ、PBTK5的構建及進入MM294大腸桿菌的轉化。

用限制性內切酶SalI30單位將費希爾弧菌菌株MJ1的DNA（8微克）在37℃酶解處理3小時。質粒pBR322的DNA（6微克）也作同樣處理。用瓊脂糖凝膠電泳以檢測樣品，查對酶解是否接近完全。

用醋酸鈉-乙醇沉淀酶切的DNA并將干燥的沉淀物重新懸浮于水中。用400單位DNA連接酶催化使2微克費希爾弧菌（V.fischeri）DNA與0.5克pBR322DNA連接。加入200微升H2O和40微升STE飽和的苯酚終止反應。渦動混合物并離心。上清液用醋酸鈉-乙醇沉淀，并將連接過的DNA的沉淀物重新懸浮于40微升H2O中。

培養(yǎng)3并制備好用于轉化的受體菌株MM294。對照轉化組含1微克pBR322DNA（loc.Cit.）。轉化后將細胞加于含氨芐青霉素的LB平板上。不加DNA的細胞不產生菌落。在對照轉化組中得到264×106個轉化體/微克pBR322DNA。連接的混合物得到3.2×104個轉化體/微克細菌DNA，總共得到6×104個轉化體。經檢查四環(huán)素抗性基因的插入失活（因為SalI位點在四環(huán)素抗性基因上，故外源DNA的插入致使該基因失活），結果發(fā)現這些轉化突變型中有5%含費希爾弧菌DNA的插入片段，從而得到大約3000個有插入片段的菌落。而這些菌落中有七個是發(fā)光的。

對這七個含DNA的菌落分析后，選出一個含有質粒（pBTK5）-具有單一的約8千堿基的插入片段和兩個SalI位點的菌株。這一結果與Engebreht等人（loc.Cit）所述的實驗結果相符。

Ⅹ、PAChv-1的構建及其對MM294大腸桿菌的轉化。從含有按照上述Ⅸ得到pBTK5質粒的MM294菌株中提取并用CsCl-溴化乙錠純化該質粒DNA，再用限制性內切酶SalI酶介，通過瓊脂糖凝膠電泳查對酶切部分。pACYC184質粒DNA用同樣方法制備，用SalI酶切并依上述方法分析。連接并轉化到MM294大腸桿菌細胞中后，用標準方法對有氯霉素抗性（來自pACYC184）和發(fā)光（30℃）的菌落進行分析。保留含質粒（pAChv-1）的菌株，并列入永久保存菌株（ATCC53133）因其具有pACYC184的骨架和插入到pACYC184之SalI位點的能產生光的8千堿基片段。

Ⅺ、λL1、λL4、λL5、λL28、λL32、λL35和λL40的構建。

按Maniatis（loc.cit.）所述的方法，純化噬菌體λ卡龍（Charon）30DNA（0.3微克），用限制性內切酶SalI酶切并與按上述方法Ⅸ中所述作相同酶切得到的pBTK5DNA（0.5微克）連接。連接后用醋酸鈉-乙醇沉淀DNA，干燥沉淀物并重新懸浮于5微升H2O中。

按Maniafis的報導（loc.cit.）中介紹的B.Hohn方法制備包裝DNA的混合物。連接好后DNA的包裝是依照Maniatis（Loc.cit.）的設計方案進行的，并用在FT培養(yǎng)基中生長到靜止期的MM294倒平板。用把噬菌斑移入內含1mlFT培養(yǎng)基，0.1mlMM294菌生長的FT培養(yǎng)液的閃爍瓶內以檢查能產生光的噬斑。使用巴士德吸管將個別噬斑移入1毫升10毫摩爾MgSO4中。將其中之0.1毫升移入小瓶。

能產生光的噬斑的噬菌體被純化兩次，制取平板裂物并用加幾滴氯仿以儲存噬菌體制品。這些噬菌體于27℃在FT培養(yǎng)基中感染生長的菌株MM294，從而對噬菌體的光產生性質進行定。向二重瓶內加自體誘導物（Nealson，K.H.，Platt，T.，和Hastings，J.W.，1970，細菌發(fā)光系統(tǒng)合成和活性的細胞控制。J.Bacteriol，104：313-322）。有時λL1、λL35和λL40產生光比其它的噬菌體明顯晚，所產生的光也相對地少，如果噬菌體感染發(fā)生在有自體誘導物存在時，則所發(fā)射光的量即大大增加。噬菌體株λL4、λL5、λL28和λL32于感染后15-20分鐘內產生光，而且所發(fā)射的光量，隨時間而增加并于約1小時后達到最大。自體誘導物對這些噬菌體所產生的光量沒有顯著影響。

因為已被克隆的含有光基因的片段是用限制性內切酶SalI酶切的，這個片段插入到用同一酶酶切的λ卡龍30上，可能有兩個不同的定向。一種定向中，熒光素酶和醛基因（EngebrechtOp.cit.）接近λ的N基因，而ux操縱子的調節(jié)基因則靠近λ的J基因。在這個定向中，醛基因和熒光素酶基因的轉錄將只依賴于由lux的啟動子轉錄，因為轉錄方向是與λ的PL啟動子的轉錄方向相反。在此情況下，自體誘導物應該并且能夠刺激光產生。λL1、λL35和λL40很可能就是在這個定向上有插入片段的噬菌體，因為它們的光發(fā)射明顯地受到自體誘導物的激發(fā)。

第二個可能的定向是lux操縱子的調節(jié)基因靠近λ的N基因，而醛基因和熒光素酶基因則在J基因一側。因為醛和熒光素酶基因的轉錄方向與λ的PL啟動子轉錄方向相同，所以這些基因不僅用它們自身的啟動子轉錄，而且甚至更多的是用PL啟動子開始轉錄。這樣，向這些噬菌體感染的細菌培養(yǎng)物中加入自體誘導物，對光產生應是很小或者沒有影響。

這些噬菌體中的兩種即λL4和λL28，已作了研究，發(fā)現它們的插入方向與基于上述生理觀察和理論推論所預期的方向相一致。按Manialis（Op.cit.）所述的方法，用CsCl梯度純化噬菌體作為DNA來源，從λL4和λL28制備噬菌體DNA。

瓊脂糖凝膠電泳顯示用限制性內切酶SalI酶切這些DNA可產生三個大的片段，其中兩個較大的條帶是λ卡龍30的臂，其為噬菌體增殖所必需的，最小的條帶約8.8千堿基，與從pBTK5用同一酶酶切的帶相同。因此，在兩種噬菌體中插入的DNA片段似乎與最初來自費希爾弧菌屬的克隆片段相同。在λL4和λL28中插入的方向可通過用PstI限制性內切酶酶解區(qū)別。λ卡龍30具有正常λ序列，直到大約第23616堿基對（HendrixR.W.，Roberts，J.M。，Stahl，F.W.和Weisberg，R.A1983：λⅡ，冷泉港實驗室，ColdSpringHarbor，紐約，附錄Ⅱ，PP519-676）之后缺失從約近堿基對23616至28312間的b1007堿基28312到34449間序列又正常。在堿基34449處一個較早期序列本身重復并且這個重復是以堿基對22346開始。該重復繼續(xù)到堿基對23616，之后缺失（b1007）直到堿基對28312。從這個堿基對開始，正常序列繼續(xù)到大約堿基對35384，在這一點上第二個不同類型的缺失，即KH54開始，并去掉DNA直到堿基對37925。之后正常序列繼續(xù)到大約堿基對40502，在這一點上第三個類型（nin5）缺失去掉DNA直到堿基對43307。在這個堿基對之后序列正常，直到DNA末端堿基對48502（這些數字是作為正常噬菌體λ的正常堿基對等同序數給出的;見圖9）?？梢姦丝?0含有1個重復和4個缺失（其中兩個是相同的）。λ卡龍30中的各種限制性內切酶酶切位點（見圖10）的等同序號可在Hendrix的文章（Op.Cit.）之附錄Ⅲ中見到。他們估計噬菌體λ卡龍30有46757個堿基對。根據已發(fā)表的資料，該噬菌體似乎應有46331個堿基對，但就我們目的來說，這一差異并不重要。

λ卡龍30中由PstI酶切得到的限制片段的圖式可從上面對其DNA序列的描述計算出來。除去內在的SalI片段并插入lux操縱子SalI片段之后，這一圖式當然會被改變。PstI位點到堿基對22425，將與正常λ相同，也即與λ卡龍30相同。在λ卡龍30中位點22425和32009之間的部分（含有除去4696堿基對的b1007）將會產生一個4888堿基對的片段，該片段也出現于本文所述的“發(fā)光”噬菌體中。然而，該DNA插入將改變PstI位點在堿基對22425處和末端之間的樣式（與正常λ同位）。由λ卡龍30除去內在SalI片段之后，λDNA堿基對32256處（大多數末端PstI位點保留）和噬菌末端將不存在PstI位點，這是因為λ卡龍30中堿基對37005處的PstI位點因KH54缺失而被刪除。在含有l(wèi)ux操縱子的SalI片段中有一個PstI位點，其位置很接近末端（離開末端約200堿基對），而且位于操縱子的調節(jié)區(qū)域內。

據此，如果lux操縱子的PstI位點接近于λ中最后的PstI位點，則PstI酶切將產生出一個約700堿基對的小片段和一個約18-19千堿基對的大片段。這應是予期的λL1、λL35和λL40的酶切圖式。相反地，如果lux片段的PstI位點是向著λ的遠中端，那么就會得到兩個約近乎相等大小的片段（大約9和11千堿基）。λL4和λL28DNA經酶切后得到是后一種圖式，這便肯定了我們以下的推測：即lux操縱子的熒光素酶和醛基因定位到λ的近側端，并且具有如由PL啟動子轉錄相同的轉錄方向。

可能提出的最后一個問題是，λL4和λL28的結構與噬菌體和插入DNA之間它們的SalI連接點有關。λ卡龍30有四個SalI位點，這四個位點被分成兩對;在各對位點內，兩位點僅僅被499個堿基對分開，而兩位點對之間的距離約近7000堿基對。當λ卡龍30用作運載體并用SalI限制性內切酶酶切而產生λL4和λL28時，位點對之間片段將可被lux操縱子片段所替代。是否重組噬菌體含有2，3或4個SalI位點尚不甚清楚。如果只有兩個SalI位點，則lux操縱子和λDNA之間的連接是在λ的最遠中和最近中SalI位點處;如果有四個SalI位點，則lux片段便連接到λ卡龍30的兩個最里面的SalI位點。如有3個SalI位點，即表明有一對SalI位點仍存在于插入片段的一端，而另一端是一個單一的SalI位點。

λ卡龍30的7千堿基內部片段要被去掉的，因為假如不是這樣，lux操縱子的加入將導致被包裝的噬菌體DNA分子太長。

在一個凝膠板上能看到留有3或4個SalI位點時產生的?。?99堿基對）片段，但不能確定有3個還是4個位點，因每一對給出一個大小相同的片段。為解決這個問題須進行限制性內切酶ScaI酶切，因為ScaI在一對的兩個SalI位點之間酶切λDNA。這樣，如果一個或兩個ScaI位點消失，則沒有或有一對SalI位點留在重組λ中。在lux操縱子中沒有ScaI位點。ScaI在位點16420、18683、25684、27262和32801堿基對處切斷野生型λDNA。在λ卡龍30中，16420和18683處的位點存在，而在25684和27262處的位點缺失。因為λ野生型中有兩對SalI位點而不是一對，所以λ卡龍30中32801上的位點出現兩次。在入卡龍30中除在堿基對16420和18683上的位點外，在堿基對28391和35819處還有一個ScaI位點。ScaI酶切后，λ卡龍30被切為16420、2263、9708、7428和10938堿基對片段。具有l(wèi)ux操縱子和只保留2個SalI位點的重組噬菌體，在ScaI酶切后將得到16420、2263和一個大約28000堿基對的片段。存在3個SalI位點的，在用ScaI酶切后，根據一對SalI位點是否仍留在遠中或近中端，則既可得到有16420、2263、9708和大約19000堿基對的圖式，或者得到有16420、2263、大約18500和10938堿基對的圖式。存在兩對SalI位點，經ScaI酶切后將產生出16420、2263、9708、大約9300和10938堿基對的片段。

由ScaI核酸內切酶酶切分析的結果可知，λL4含有4個SalI位點，而λL28有3個SalI位點。λL28保留SalI位點的近中對和來自λ卡龍30的最遠中SalI位點。λ野生型、λ卡龍30、λL4和λL28的這一結構在圖9上圖解分別為10、11和12。

Ⅻ、能轉移發(fā)光的Hfr株的構建。

將Hfr大腸桿菌K12菌株AT2446變成為發(fā)光噬菌體λL28溶源性菌株，這可通過以λL28和λcI+同時感染AT2446來完成。后一種噬菌體為提供整合功能、整合的λatt位點以及活化阻遏物基因以產生溶源化所必需。：λL28中這三者均缺乏。通過繼后用本身不能致溶源但能殺死非溶源源菌的λCIb2噬菌體攻擊除掉非溶源細胞。分離出產生光的、紫外光誘導后產生噬菌體及攜帶發(fā)光基因的幸存細胞。

ⅩⅢ、生物發(fā)光檢測。

將體內發(fā)光試樣放在閃爍瓶內，用與Mitchell和Hastings所述相似的光電倍增管光度計（Mitchell，G.W.，和Hastings，J.W.，1971：一種穩(wěn)定的廉價固態(tài)，光電倍增管光度計。Anal.Biochem.39：243-250）檢測。當發(fā)光強度低于106量子/秒時，于25℃使用的閃爍計數儀（Paokard2001型）該儀器應在3H定位上不重合。發(fā)光是使用Hastings和Weber的標準（Hastings，J.W.，和G.Weber，1963：各方同源的總量子通量。J.Opt.Amer，53：1410-1415）以每秒量子（量子/秒）表示。

ⅩⅣ、從費希爾弧菌MJ-1制備自體誘導物。

為了制備含自體誘導物的無細菌條件培養(yǎng)基，把費希爾弧菌MJ-1接種在ASWRP液體培養(yǎng)基中，于22℃震搖培養(yǎng)。將有高度發(fā)光的生長對數期晚期培養(yǎng)物（80-100Klett單位，濾器66）于4℃以10，000g離心15分鐘。使上清液通過0.22微米孔徑的濾膜（Millipore公司產品）除菌。這些制品于4℃可儲存長達30天而不喪失活性。

對費希爾弧菌自體誘導物的生物學分析使用先前Nealson所述的方法進行（Nealson，K.H.，Platt，T.，和Hastings，J.W.，1970：細菌發(fā)光系統(tǒng)之合成與活性的細胞控制。J.Bacteriol.104：313-322）。

ⅩⅤ、β-半乳糖苷酶的分析

依據Miller的方法（Op.cit.）進行分析。應用氯仿和SDS（十二烷基磺酸鈉）以使細胞能透過鄰硝基苯半乳糖苷（ONPG）。

ⅩⅥ、保存。

已經說明，本發(fā)明的構建物（即質粒和噬菌體）已在美國標準菌種保藏中心（ATCC）（Rockville，MD20852，U.S.A.）作永久保存。

2、圖的目錄

本發(fā)明附圖圖解的說明如下：

圖1：用噬菌體λL28轉導方法檢測大腸桿菌菌株W3110;

圖2：用噬菌體λL4轉導以檢測大腸桿菌菌株W3110;

圖3：用1微克pBTK5DNA轉化以檢測大腸桿菌K菌株MM294不同濃度。

圖4：在用1微克pBTK5DNA轉化檢測大腸桿菌菌株MM294中細胞濃度和光發(fā)射出現之間的相互關系;

圖5：于各種抗生素存在下用1微克pBTK5DNA轉化大腸桿菌菌株MM294時發(fā)光的動力學;

圖6：用1微克pBTK5DNA轉化大腸桿菌菌株MM294的特異性;

圖7：用接合方法檢測大腸桿菌菌株W3110;

圖8：用噬菌體λcI857S7plac5轉導以檢測大腸桿菌菌株CSH1;

圖9：λ野生型的相對的限制性內切酶酶切位點圖譜;

圖10：λ卡龍30的相對的限制性內切酶酶切位點圖譜;

圖11：λL4的相對的限制性內切酶酶切位點圖，拓樸特征，從lux啟動子轉錄，以及從PL轉錄示意圖。

圖12：λL28的相對的限制性內切酶酶切位點圖，拓樸特征，從lux啟動子轉錄，以及從PL轉錄示意圖。

3、特定實施例

通過以下實施例進一步說明本發(fā)明。這些實施例只是作為范例以闡明本發(fā)明的一般的和廣泛的原則，無論如何不能將其看作是對本發(fā)明的限制。

實施例1：用噬菌體λL28轉導檢測大腸桿菌菌株W3110。

將大腸桿菌W3110接種在FT培養(yǎng)液中30℃培養(yǎng)生長到對數前期。將培養(yǎng)物稀釋10倍，取兩份每份1毫升并把此樣品移入無菌閃爍瓶中。每瓶加25微升λL28，效價為5×109PFU/毫升（PFU＝噬斑形成單位）。依前述材料和方法Ⅺ部分中所述制備λL28（ATCC40183號）噬菌體。將瓶置于閃爍計數儀中，于25℃溫育并按上述材料和方法ⅩⅢ中所述將發(fā)光作為時間的函數檢測。圖1所表示的是溫育60和120分鐘后作為大腸桿菌濃度之函數的發(fā)光量。本底計數為15，000opm。

實施例2：用噬菌體λL4轉導以檢測大腸桿菌菌株W3110。

將大腸桿菌在FT培養(yǎng)液中培養(yǎng)。用鹽水（100毫升）稀釋培養(yǎng)物，分別得到終濃度為101、102、103和104細胞/毫升的稀釋液。將各為100毫升的樣品通過0.45微米M：llipore濾膜用面向上放置在無菌閃爍瓶中進行過濾。各瓶加1毫升含λL4（7×107PFU/毫升）的培養(yǎng)液。λL4依上述材料和方法Ⅺ制備的。按上述材料和方法ⅩⅢ所述，于22℃培養(yǎng)40、60和100分鐘后測定各瓶的發(fā)光量。圖2表示光發(fā)射（CPM）和大腸桿菌的細胞濃度之間的關系。

實施例3：用λcI857plac5轉導以檢測大腸桿菌菌株CSH1。

大腸桿菌菌株CSH1在FT培養(yǎng)基中，于37℃震蕩培養(yǎng)。37℃培養(yǎng)20小時后，在LB平板上肉眼計數，檢定每毫升的細胞數目。用FT無菌培養(yǎng)基將對數生長的細胞稀釋2倍。各瓶內加入異丙基硫代半乳糖苷（Sigma產品，產品目錄號15502），使其終濃度達到100毫摩爾。

加λcI857plac5噬菌體，達到終濃度為109噬斑形成單位/毫升。終體積為2毫升。將小瓶于37℃震蕩培養(yǎng)45分鐘。之后加2毫升Z緩沖液（Miller，op.cit.）再加0.1毫升氯仿和0.05毫升SDS（0.1%）。借助渦動混勻器將小瓶內容物混合（30秒）并向各瓶加0.8毫升ONPG（8毫克/毫升）。ONPG用0.1摩爾磷酸鈉緩沖液PH7.0中配制。將小瓶于37℃用輕微震蕩培養(yǎng)60分鐘，并加2毫升Na2CO3（1摩爾）終止反應。用Bausch和LombSpectronic20分光光度計于420毫微米（鄰位硝基苯酚）和550毫微米（由細胞物質引起的混濁）檢測顯色反應。

圖8所表示的是作為細菌濃度之函數的（用酶學分析法所測得的）β-半乳糖苷酶的量。

實施例4：用pBTK5轉化以檢測大腸桿菌K菌株MM294。

依上述材料和方法Ⅸ中所述從費希爾弧菌DNA的發(fā)光系統(tǒng)片段和質粒PBR322制備重組DNApBTK5。取1微克pBTK5DNA轉化懸浮于0.2毫升CaCl2中的不同濃度的大腸桿菌K菌株MM294。轉化后，將細胞移入含有0.8毫升LB及0.2毫升加有自體誘導物（依上述材料和方法ⅩⅣ制備）的LB培養(yǎng)基的閃耀瓶內。各瓶中細胞濃度分別為105、106、107和108細胞/毫升。圖3表示四種不同濃度大腸桿菌細胞之光發(fā)射的動力學;圖4說明這些實驗中細胞濃度與光發(fā)射出現之間的相互關系。本底光發(fā)射為1000opm。

實施例5：各種抗生素存在下大腸桿菌菌株MM294的轉化。

按實施例3的方法完成轉化并將轉化了的細菌于各種抗生素存在下繼續(xù)培養(yǎng)。氨芐青霉素（AMP）30微克/毫升;氯霉素（CAP）10微克/毫升;卡那霉素（KAN）30微克/毫升;四環(huán)素（TET）10微克/毫升。圖5表示有或沒有抗生素時發(fā)光的動力學。本底光發(fā)射計數為1000cpm。

實施例6：用pBTK5DNA轉化多種細菌。用實施例3的方法完成轉化。用于轉化的受體細菌有大腸桿菌菌株MM294，產氣氣桿菌菌株62-1，普遍變形桿菌和白色葡萄球菌。圖6表示作為時間函數的光發(fā)射水平（Cpm），從中可以看出只有大腸桿菌被轉化而其它三種細菌則未被轉化。這一結果證明了用重組DNApBTK5轉化的特異性。本底計數為1000opm。

實施例7：接合方法檢測大腸桿菌菌株W3110。

按材料和方法Ⅻ所述構建含有發(fā)光基因的HfrH（高頻率接合）菌株。將該菌株放在含有鏈霉素（2.5微克/毫升）的LB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)2小時。將細胞洗一次并稀釋到LB培養(yǎng)基使細胞終密度為107細胞/毫升。向以1毫升等分的這種培養(yǎng)物中加入不同濃度的（非發(fā)光）大腸桿菌菌株W3110細胞。將混合好的培養(yǎng)物于37℃不震蕩培養(yǎng)30分鐘，之后取培養(yǎng)物置于閃爍計數儀中于24℃進行發(fā)光檢測。圖7表示在不同濃度大腸桿菌W3110受體細胞存在下，發(fā)光產生作為時間的函數（由0時間開始）。

實施例8：分離、克隆和外源基因轉移進入微生物寄主的一般方法，以及用引入的供體基因系統(tǒng)的表達來檢測受體寄主。

前面已經談到，除了熒光素酶和β-半乳糖苷酶之外，還可根據本發(fā)明的方法按檢測目的將酶或其它系統(tǒng)引入宿主生物體內。能被選擇的系統(tǒng)或酶。由于它容易用這些方法能被檢測到，或者由于它是獨一的，可以查明在生物體中它的不存在。以前所述的熒光素酶系統(tǒng)即具有這兩方面的性質，因此是本發(fā)明優(yōu)先選用的。為了用類似于檢測熒光素酶的方法檢測微生物，還可使用編碼蛋白質的基因如其存在可通過它們對某些波長的光的吸收〔如血紅蛋白〕或通過特異性抗體，經放射標記或連接到便于被檢測的酶（ELISA）上或其它化合物如生物素上。在其它情況下，編碼那些其單一產物或多數產物能直接或間接地被測定或者其一種底物的消失也能被同樣測出的酶的基因，更是適用的。這樣的酶的例子將在下面的幾個實施例中給出。測定方法可以是基于氣體的釋放或被溶解氣體之濃度的降低、pH改變、產物或底物可用分光光度法或色譜法直接測量、或通過去偶聯(lián)反應間接測量，或用次級復合物（如生物素-抗生物素蛋白）的抗體檢測，或通過使用放射標記的化合物等檢測。這些用于定目的的測量方法只是在這里羅列出來，而不是想要限制本發(fā)明的范圍，但是想指出這種系統(tǒng)類型可以接合我們的方法使用。有代表性的酶、蛋白質或酶系在與其相當的遺傳結構被裝配后即可用于檢測微生物。這種裝配可包括自然重組或使用體外重組技術，亦可兩者兼用。有許多可能性及設計方案是與本發(fā)明相一致的。

包括外源基因和引入寄主生物體的各種分離、克隆和轉移方法均可很便利地在本發(fā)明中應用。例如，可分離出供體生物（細菌、酵母等）的DNA，并用限制性內切酶Sau3A部分酶解，以產生一組包含整個供體基因組的交迭片段。可通過甘油或蔗糖梯度離心或瓊脂糖凝膠電泳方法制備特定大小的片段。這些片段含有外伸的5′單鏈末端，具有結構5′GATC-雙鏈DNA;可用T4DNA連接酶與用限制性內切酶（BamHI、BglⅡ、BclⅠ、Sau3A）酶介產生適當和相類似的單鏈末端的適當運載體分子相連接。這樣運載體的例子便是用限制性內切酶BamHI切斷的λ卡龍28（Maniatis等，Op.cit.）。連接好的DNA就可被轉化，如果要求包裝可繼包裝后，進入適當寄主（缺少限制系統(tǒng)）中。含有所要的外源系統(tǒng)或酶之序列的病毒DNA既可通過酶活性、免疫技術、也可用合成的或天然的DNA探針以及核酸雜交方法進行檢測。Maniatis等人（Op.cit.）已詳細描述了上述的多種克隆和檢測技術。其次，亞克隆供體基因并與強有力的細菌啟動子（如大腸桿菌的plao或噬菌體λ的PR）連接。然后用重組（自然的、體外的兩者兼用的）技術將啟動子-基因片段轉移到一種接合質粒（如RP4或F因子）、可轉化構件（如質粒pBR322）或一種適當噬菌體（如λ或T4）中。

如此轉移到受體宿主微生物中的被表達的供體基因或基因系統(tǒng)即可用以定宿主生物體。可選用一種適當方法以監(jiān)測宿主生物體中供體遺傳系統(tǒng)的活性（如由熒光素酶引起光產生;酶學反應的終產物或中間體;氣體排出等）。因此，自供體生物中基因的分離、克隆及向受體寄主微生物內轉移外源基因，以及通過對其中所含之外源基因表達的監(jiān)測以定宿主微生物，均影響到本發(fā)明的實施效果。

實施例9：使用得自外來供體的醇脫氫酶或其它NAD氧化還原酶基因系統(tǒng)轉移到受體宿主微生物中以檢測該宿主的方法

醇脫氫酶（E.C.1、1、1、1;醇：NAD氧化還原酶）是一種許多種生物如酵母、人和芽胞桿菌產生的酶?？赏ㄟ^重組DNA技術分離到編碼這種酶的單個基因或基因族。用實施例8的方法分離作為供體生物酵母的DNA，用限制性內切酶處理、克隆、與一個有效的細菌啟動子相連并由一個適宜的運載體（最好是噬菌體）轉移到受體宿主微生物中。

之后便可通過前面所提到的涉及檢測熒光素酶和β-半乳糖苷酶的相似技術和實驗設計，用醇脫氫酶（ADH）檢測特定微生物的存在。在使用ADH的情況下，將不能直接地監(jiān)測光產生;而是測定NAD+向NADH的轉化。在醇和NAD+存在下，ADH催化，其產物是NADH、H+和乙醛的反應。通過測定340毫微米波長的吸光率或于適當的醛存在下測定細菌熒光素酶而測知NADH的存在和濃度（Stanley，P.E.：酶學方法，第LⅦ卷，M.A.Delucs編，Academio出版社1978，NewYork，SanFrancisco，Londen，215-222頁）。

還有許多其它的DNA氧化還原酶也如ADH（酶的E.C.組1.1.1，1.2.1，1.3。1，1.4.1.，1.5.1和1.8.1）一樣適用于檢定宿主微生物。例如L-丙氨酸脫氫酶（E.C.1.4.1.1.，L-丙氨酸：NAD氧化還原酶）也能由NAD+產生NADH。另外，這種酶當L-丙氨酸被轉化為丙酮酸和氨時，能催化由L-丙氨酸釋放出NH3，要測定的產物是NH3而不是NADH。其它氧化還原酶是以O2代替NAD+作為電子受體（E.C.1。1.3，1.2.3，1.3.3和1。4.3），可用氧電極測知溶解之氧的消失。

實施例10：使用得自外來供體編碼轉移酶的遺傳系統(tǒng)并轉移到受體宿主微生物以檢測該宿主的方法。

連同在文中所述的本發(fā)明之方法，也可用轉移酶系統(tǒng)定微生物。用實施例8的方法，分離含有選擇過的轉移酶基因的適當供體生物的DNA，用限制性內切酶酶解、克隆、連接到一個有效的細菌啟動子上，并用適當的載體（最好是噬菌體）轉移到一種受體宿主微生物中。例如，在2-酮戊二酸存在下，L-酪氨酸;2-酮戊二酸氨基轉移酶（E.C.26.1.5）催化由L-酪氨酸產生對位羥苯基丙酮酸，而對位羥苯基丙酮酸則可從測定330毫微米的吸光率監(jiān)測（Hadar，R.，Slonim，A。，和Kuhn，J.，1976.在D-色氨酸在被大腸桿菌利用中D-色氨酸氧化酶的作用。J.Bacteriol125：1096-1104）。第二個轉移酶的例子是半乳糖激酶（ATP：D-半乳糖-1-磷酸轉移酶;E.C.2.7.1.6）其活性表現于ATP的消失和β-D-半乳糖-1-磷酸的產生。對于特殊選擇的轉移酶可使用其它相應的檢測方法。

實施例11：使用得自外來供體的水解酶、裂合酶或異構酶遺傳系統(tǒng)并轉移到受體宿主微生物以檢測該宿主的方法。

除了前面所述的酶以外，還可使用水解酶、裂合酶和異構酶系統(tǒng)連同本發(fā)明的方法定微生物。使用實施例8的方法，分離含有選擇過的酶（水解酶、裂合酶或異構酶）的適當供體生物的DNA，用限制性內切酶酶解，克隆，連接于一個有效的細菌啟動子，并通過適當的運載體（最好是噬菌體）轉移到受體寄主微生物。例如，可以用許多方法檢測鹼性磷酸酶（E.C.3.1.3.1，（正）磷-酯磷酸水解酶）活性，其中之一是通過由對位硝基苯磷酸酯釋放對位硝基苯，而對位硝基苯的濃度則可通過分光光度法于420毫微米波段在堿性PH條件下測得，以同樣方法鄰位硝基苯也能用于檢測β-半乳糖苷酶〔E.C.3.2.1.23〕活性。某些裂合酶如天冬氨酸-1-脫羧酶（E.C.4.1.1.11，L-冬氨酸-1-羧酶）和鳥氨酸脫羧酶（E.C.4.1.1.17，L-鳥氨酸羧化酶）可通過PH的改變而檢測出CO2（作為H2CO3）的釋放，故也是同樣適用的。異構酶如谷氨酸消旋酶（E.C.5.1.1.3）也能被使用。在使用谷氨酸消旋酶中，谷氨酸由D型轉變到L型，可以與L-谷氨酸氧化酶測定系統(tǒng)結合起來接在常規(guī)方法之后。

實施例12：使用得自外來供體氧化酶遺傳系統(tǒng)并轉移到受體寄主微生物以檢測該寄主的方法。

將酶活性引入該酶活性低或沒有該酶活性的目的宿主微生物中。使用實施例8的方法，從適當供體生物中分離含有經選擇的酶（即氧化酶）的DNA，用限制性內切酶處理，克隆化，連接于一個有效的細菌啟動子并通過適當載體（最好是一種得有特異性的噬菌體）轉移到受體寄主微生物中。在本發(fā)明中可應用的酶，包括，例如D-色氨酸氧化酶（Hadar等，Op.Cit.），這種酶在大腸桿菌中幾乎不存在，將導致高水平的酶活性的突變基因引入大腸桿菌，可通過從D-色氨酸產生的吲哚丙酮酸進行檢測。也可將含大腸桿菌之bioB基因的構件連到強有力的啟動子上，即可使去硫代生物素很快轉化為生物素，后者則可基于抗生物素蛋白對生物素的高度親和力進行檢測。

4、結果

A、轉導

噬菌體通過吸附接著就將其DNA注入適宜細菌宿主而體內進行自身增殖。自然條件下，噬菌體基因有時可通過代替和/或插加連接到細菌基因上。特定情況下，某些噬菌體會包裝偶然來自該種噬菌體以外其它來源（即染色體、質?；蚱渌N噬菌體）的DNA。前者稱為局限性轉導，后者稱為普遍性轉導。這兩種現象均導致DNA由一個細菌轉移到另一個細菌。產生局限性轉導噬菌體的一種更現代的方法可以通過重組DNA技術來完成。可構建攜帶我們要求之基因的噬菌體，而且在其中不會使主要噬菌體基因丟失。如果存在一種適合的宿主，這樣的噬菌體將會有效地引入這些克隆好的基因。如果存在它們的表達所需要的原件，那么這些基因將會高效表達，因為在噬菌體生長，它的染色體要增殖成好多拷貝。

根據本發(fā)明的突出特征，將可把帶有V.fischeri之發(fā)光基因的DNA片段從質粒pBTK5轉移到大腸桿菌噬菌體λ中。通過適當的構建亦可轉移其它供體遺傳系統(tǒng)。

通過感染，噬菌體吸附于能夠起到宿主作用的特定細菌，被包裝的噬菌體頭部DNA即注入細菌細胞內。一旦該DNA進入細菌內部，則它就利用宿主的功能系統(tǒng)，經轉錄并翻譯以產生發(fā)光酶（熒光素酶及醛合成所必須的酶）或其它可被引入的酶系統(tǒng)。

發(fā)光系統(tǒng)的使用是本發(fā)明之突出特征所在。因為無論噬菌體還是細菌，其本身都不能發(fā)射光，所以繼感染后的發(fā)光水平可被用以檢測細菌的存在，而光發(fā)射的量則反映出噬菌體-細菌復合體的數目。在有過多噬菌體存在時，發(fā)光量也能反映細菌的濃度。使用這樣技術，可以一小時內檢測濃度小于104個大腸桿菌細胞/毫升的樣品（圖1）。當含有細菌的樣品通過MilliporeHA0.45微米濾器過濾濃縮后，可檢測出小至10個細胞/毫升的細菌濃度。

當存在一種對寄主細胞敏感的抗生素時，感染性噬菌體便不能完成其溶菌周期，發(fā)光量會降低或者沒有光發(fā)射。阻斷DNA、RNA或蛋白質合成的抗生素被試驗時，顯示出光的較低輸出。影響細胞壁合成或膜完整性的抗生素也出現相似的結果。因此，某種細菌類型，通過帶有發(fā)光基因噬菌體的感染如能被檢測出來，則該細菌寄主對抗生素的敏感性，也能夠通過測定抗生素對光發(fā)射的影響很快地被測知。

如圖3所示，細菌的存在亦可通過酶學方法，使用轉導技術檢測。存在有足夠數目的細菌細胞時，被帶有β-半乳糖苷酶編碼之基因的噬菌體感染，結果便由其重新合成β-半乳糖苷酶，后者的存在和活性則可用酶分析法測定。感染之復合體的數目越大，所產生的酶的量越多。

利用帶有色氨酸酶基因的λ噬菌體和缺失色氨酸酶活性的菌株也可完成相類似的實驗，同樣地，這種細菌的存在會導致酶產生，但要有相對高的細胞濃度（109細胞/毫升）時才能檢測到。

某種單一細菌的菌種內。噬菌體一般只能在某些或所有菌株上生長。有時某種類型的噬菌體能感染幾種細菌，但這些菌種幾乎都是親緣關系密切的。通過選擇適當的噬菌體類型，能夠檢測如予定的那種特異的細菌，這就是說，不僅能夠在這種試驗中檢測細菌的存在，而且也能迅速地檢測某些特定類型細菌的存在或不存在。例如期望檢測大腸桿菌，可將攜帶發(fā)光基因的噬菌體與噬菌體在這種細菌范圍內所有已知菌株的寄主相混合，從而迅速而特異地檢測到這種細菌的存在。

B、轉化

這些實驗說明通過用攜帶生物發(fā)光基因或其它供體基因的相親和的DNA轉化細菌以檢測這些細菌的存在，用這一技術還可測知細菌的大致數目、它們的分類位置及它們對抗生素的敏感性。

當分別用材料和方法Ⅸ及Ⅹ部分得到質粒pBTK5和pAChv-1轉化大腸桿菌菌桿JM101和MM294時，于幾小時內即可發(fā)射出可檢測到的光，沒有加DNA或只有DNA的則是暗的。光發(fā)射的水平為本底的幾千倍。

在另一實驗中測定了當所加DNA為恒定（1微克）而所加細胞數不同時的光發(fā)射量。結果如圖3所示，說明光發(fā)射開始的時間是與細胞濃度呈負相關。這一點清楚地顯示于圖4中，圖4中是對光發(fā)射開始的時間對細胞濃度作圖，所得到的線性關系表明該方法亦可用于估計細胞濃度。

用產生光的基因轉化的另一個應用是在于檢測細菌對抗生素的敏感性。方法中使用的質粒是pBTK5（1微克）和菌株MM294。轉化后加入抗生素并檢測它們對光發(fā)射的影響。實驗的對照組是沒有加質粒DNA的經CaCl2處理的細胞，以及沒有加抗生素的經過轉化的細胞。圖5表示的是得到的實驗結果。卡那霉素（30微克/毫升）和氯霉素（30微克/毫升）完全阻止光產生。四環(huán)素（10微克/毫升）相對于不加抗生素的對照組引起了90%的降低。氨芐青霉素（30微克/毫升）實際上刺激光產生。氨芐青霉素不會抑制或輕微抑制光產生是已予想到的，因為pBTK5帶有氨芐青霉素抗性的基因。未予想到的刺激作用可能是由于選擇增加復制的進入之質粒，或者是由于通過bla基因（氨芐青霉素抗性）啟動子增加了光基因的轉錄。由此，可通過用生物發(fā)光基因轉化，可很迅速地檢測某細菌群體對某種抗生素（這些實驗中用的氯霉素、四環(huán)素和卡那霉素）的敏感性。細菌的抗性（抗氨芐青霉素）也能迅速測出。此外，還能迅速地確定作為其濃度之函數的抗生素的活性（四環(huán)素與氯霉素和卡那霉素比較）。通過該試驗也能測定亞最適濃度或部分抗性（四環(huán)素）。

轉化的另一個特點是它的特異性。如上所示，本方法能很快地檢測大腸桿菌的兩個菌株。當一個實驗是用pBTK5DNA轉化大腸桿菌、普通變形桿菌、白色葡萄球菌和產氣氣桿菌時，只有大腸桿菌發(fā)射光（圖6）。正因為氣桿菌屬和變形桿菌屬與大腸桿菌關系相當密切，故這一點顯示出這個試驗方法具有很高的特異性。

C、接合

某些細菌具有向其它細胞（接受體）供出其DNA的能力。這一過程即所謂接合是由質粒介導的;質粒是環(huán)狀DNA分子，其存在對細胞的健康常常不是必要的。并不是所有的質粒都能啟動接合，而只有具有轉移基因的質粒才能夠有此功能。當質粒是作為游離的非整合分子存在時，它通常介導其自身由供體向受體轉移，并且只是偶然轉移其它質?；蚣毦旧w分子。然而，當一個接合質粒整合到染色體中時，它主要是轉移染色體，而在轉移自身中很少成功?？赡艿氖荏w的范圍取決于接合質粒本身。例如，質粒RP4在親緣關系相當遠的革蘭氏陰性菌之間能進行自身轉移，而質粒F+能自身轉移去的菌少得多，只是關系密切的類型。

大腸桿菌K12菌株AT2446是按前述材料和方法Ⅻ所述方法成雙溶源性的Hfr菌株。AT2446是-HfrH菌株，因此將其DNA轉移到自0分鐘開始的受體。供體DNA由（Bachmann，B.J.和K.B.Low，1980：大腸桿菌K12聯(lián)鎖圖，第6版，Microbiol.Rev.44：1-56）-第一個細菌染色體標記thr順時鐘方向轉移，而在大約最后91分鐘轉移BalB。因為噬菌體λ的附著位點是在17分鐘，故HfrH應該相當早地并以很高效率轉移溶源性病毒（在這種情況中是多個病毒）當λ向非溶源菌株發(fā)生轉移時，即會出現接合子誘導。這種現象是進入胞漿的病毒基因組缺乏λ的阻遏物結果所造成。沒有基因阻遏物，基因即開始自我表達噬菌體本身從細菌染色體上切離出來，并進入溶菌環(huán)。這就是導致每個細胞大約有300個λ的基因組，并將以高水平表達發(fā)光基因，這是因為它們由λ啟動子PL啟動而高效轉錄，而該啟動子過去是被抑制的。

在這些菌株中會出現某些本底光發(fā)射，這是因為發(fā)光基因將會用它們自身的啟動子進行表達。我們已發(fā)現，本底光通過用亞致死濃度的鏈霉素培養(yǎng)供體菌株可在很大程度上得到抑制。發(fā)現鏈霉素能選擇地抑制發(fā)光系統(tǒng)的誘導，而幾乎不影響生長的速度。

實施例6中描述了一項說明應用接合和發(fā)光的實驗，結果如圖7所示，可以看出發(fā)射之光量在一個給出的供體濃度時是與受體細胞的濃度直接相關的。圖7中曲線表明了發(fā)射光與受體濃度之間的線性關系?？股厝缏让顾兀?0微克/毫升）和鏈霉素（100微克/毫升），當菌在交配期間放入時，可完全地抑制發(fā)射光的增加。

使用這一技術，有可能確定樣品中細菌的存在、數量和其對抗生素的敏感性。接合并不只限于Hfr菌株或溶源性噬菌體。任何含有在寄主生物體中，在可移動的復制子中，不存在或表達很弱的發(fā)光系統(tǒng)或部分或其它供體遺傳系統(tǒng)的菌株均可應用。復制子可以是細菌染色體或質粒。發(fā)光系統(tǒng)或其部分或者其它遺傳系統(tǒng)，可通過噬菌體或遺傳重組天然的或人工的等方法而被引入，從而發(fā)光基因或其它基因即可共價結合于轉移的遺傳物質上。因此接合的應用相似于上述的光偶聯(lián)的轉導和轉化。