本技術(shù)屬于生物醫(yī)學(xué)工程材料領(lǐng)域，具體涉及具有bmp-2緩釋功能的可注射3d多孔復(fù)合水凝膠及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、肩袖撕裂可導(dǎo)致肩關(guān)節(jié)疼痛及活動(dòng)受限，常需手術(shù)修復(fù)。雖然醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步已使療效逐步改善，但術(shù)后仍有相當(dāng)比例患者存在功能受限和再撕裂問(wèn)題。修復(fù)失敗的關(guān)鍵部位在于肌腱-骨界面(tendon–bone?interface,tbi)，其天然結(jié)構(gòu)由肌腱、非鈣化纖維軟骨、鈣化纖維軟骨及骨組織構(gòu)成四層梯度結(jié)構(gòu)。手術(shù)重建后的tbi通常形成以ⅲ型膠原為主的纖維血管瘢痕組織，力學(xué)強(qiáng)度不足導(dǎo)致再撕裂率高。此外，界面處細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，且無(wú)法形成有序的膠原纖維排列，致使特征性纖維軟骨過(guò)渡帶難以再生。目前，tbi的有效整合仍是臨床面臨的重大挑戰(zhàn)，因此研究者積極探索多種組織工程策略以促進(jìn)肩袖愈合。

2、tbi天然結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性決定了界面損傷后，若無(wú)外界干預(yù)則難以建立適宜的生化微環(huán)境。因此，設(shè)計(jì)合適的微環(huán)境導(dǎo)向材料對(duì)促進(jìn)再生細(xì)胞的遷移、增殖及信號(hào)傳導(dǎo)至關(guān)重要?，F(xiàn)有研究多基于平面生物材料開(kāi)展體外細(xì)胞相互作用實(shí)驗(yàn)，但二維結(jié)構(gòu)附著的細(xì)胞無(wú)法真實(shí)模擬細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular?matrix,ecm)環(huán)境。為解決這一局限并適配不規(guī)則形狀缺損，可注射生物材料備受關(guān)注。其中，水凝膠因其預(yù)聚態(tài)可模擬ecm的理化特性而被廣泛應(yīng)用，其三維(3d)結(jié)構(gòu)不僅能封裝細(xì)胞，還可負(fù)載并緩釋生物活性成分。水凝膠對(duì)細(xì)胞行為的影響具有多維度特性，優(yōu)化其內(nèi)部結(jié)構(gòu)可增強(qiáng)細(xì)胞相容性、組織整合及宿主應(yīng)答。增加孔隙率或孔徑通常能促進(jìn)ecm分泌、細(xì)胞浸潤(rùn)、組織生長(zhǎng)及分子遞送。鑒于水凝膠的尺寸限制，研究者已開(kāi)發(fā)出多種大孔水凝膠制備方法(如氣體發(fā)泡、冷凍干燥和粒子瀝濾等)，但多數(shù)方法需在水凝膠成型后接種細(xì)胞，因細(xì)胞分布難以控制而阻礙了均勻的3d封裝。因此，亟需采用成本低廉且生物相容性優(yōu)異的致孔劑構(gòu)建多孔水凝膠體系，為細(xì)胞提供更適宜的3d微環(huán)境。

3、從組織微環(huán)境角度看，肩袖損傷常伴隨微環(huán)境破壞，導(dǎo)致活性氧(reactiveoxygen?species,ros)過(guò)度生成。ros的長(zhǎng)期積累會(huì)進(jìn)一步增加促炎細(xì)胞因子分泌，形成慢性炎癥循環(huán)。干細(xì)胞與生物活性因子被公認(rèn)為抑制氧化應(yīng)激、降低ros水平的關(guān)鍵要素。干細(xì)胞的治療效應(yīng)主要依賴其旁分泌功能，其分泌的旁分泌因子或外泌體可遷移至炎癥部位，通過(guò)細(xì)胞間通訊調(diào)控靶細(xì)胞活性與功能。干細(xì)胞的生物活性可下調(diào)nf-κb通路、減輕炎癥反應(yīng)并促進(jìn)tbi愈合。其中，脂肪源性干細(xì)胞(adipose-derived?stem?cells,adscs)因易獲取且旁分泌效應(yīng)強(qiáng)，已成為再生治療的研究焦點(diǎn)。因此，選用adscs作為種子細(xì)胞可增強(qiáng)組織工程水凝膠的生物學(xué)功能。

4、除病原清除與炎癥調(diào)控外，生長(zhǎng)因子的整合對(duì)組織修復(fù)至關(guān)重要。生長(zhǎng)因子是細(xì)胞進(jìn)程的核心調(diào)節(jié)者，既能調(diào)控外源干細(xì)胞的旁分泌活性，又可操縱內(nèi)源干細(xì)胞激活固有修復(fù)機(jī)制。目前已有多種生長(zhǎng)因子(如血小板衍生生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和骨形態(tài)發(fā)生蛋白等)被用于tbi研究，但多數(shù)因子難以滿足長(zhǎng)期修復(fù)需求。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bonemorphogenetic?protein?2,bmp-2)因強(qiáng)效的骨誘導(dǎo)能力已應(yīng)用于臨床，其可促進(jìn)軟骨分化并增強(qiáng)纖維軟骨ecm成分(如蛋白聚糖和ⅱ型膠原)的合成，因而可能成為增強(qiáng)干細(xì)胞旁分泌活性、重建纖維軟骨過(guò)渡帶的關(guān)鍵信號(hào)分子。盡管大量研究證實(shí)bmp-2對(duì)tbi愈合的積極作用并闡明相關(guān)機(jī)制，但關(guān)于bmp-2如何協(xié)同干細(xì)胞貫穿從創(chuàng)傷初期到修復(fù)后期的動(dòng)態(tài)過(guò)程，目前尚未明確，這可能是tbi愈合機(jī)制的新突破口。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了克服上述技術(shù)問(wèn)題，本技術(shù)提供了具有bmp-2緩釋功能的可注射3d多孔復(fù)合水凝膠及其制備方法和應(yīng)用。

2、一方面，本技術(shù)提供了一種具有bmp-2緩釋功能的可注射3d多孔復(fù)合水凝膠hms/mbs/adscs的制備方法，包括以下步驟：

3、步驟1、制備明膠微球(gms)和未交聯(lián)的甲基丙烯酰化明膠水凝膠微球(gmms)；

4、步驟2、將步驟1獲得的未交聯(lián)的甲基丙烯?；髂z水凝膠微球(gmms)浸泡于骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bmp-2)溶液中，低溫過(guò)夜，分散至濃度為0.4-0.6％的光引發(fā)劑中，紫外線固化，獲得負(fù)載bmp-2的gmms微球(gmbs)；

5、步驟3、將透明質(zhì)酸甲基丙烯酸酯(hama)溶解于濃度為0.4-0.6％的光引發(fā)劑中，獲得透明質(zhì)酸甲基丙烯酸酯(hama)溶液，然后將步驟1中所述的明膠微球(gms)和步驟2中所述的gmbs混合于透明質(zhì)酸甲基丙烯酸酯(hama)溶液中，獲得hms/mbs水凝膠前體；

6、步驟4、將脂肪來(lái)源干細(xì)胞(adscs)與步驟3獲得的hms/mbs水凝膠前體混合，紫外線固化后，即得hms/mbs/adscs復(fù)合水凝膠。

7、采用上述技術(shù)方案，本技術(shù)選用adscs作為種子細(xì)胞，為構(gòu)建適宜adscs的微環(huán)境，利用明膠微球(gelatin?microspheres,gms)的熱敏性作為致孔劑，將其摻入透明質(zhì)酸甲基丙烯酸酯(hyaluronic?acid?methacrylate,hama)中形成微孔，從而構(gòu)建3d多孔水凝膠結(jié)構(gòu)(hms)。進(jìn)一步采用甲基丙烯酰胺明膠(gelatin?methacryloyl,gelma)水凝膠微球(gmms)高效負(fù)載bmp-2。簡(jiǎn)言之，將adscs與hms混合，并整合負(fù)載bmp-2的gmms(gmbs)，開(kāi)發(fā)出具有bmp-2緩釋功能的可注射3d多孔水凝膠細(xì)胞負(fù)載體系(hms/mbs/adscs)。

8、在某些實(shí)施例中，所述步驟1包括以下步驟，

9、步驟11、將乙酸乙酯分別與明膠溶液、甲基丙烯?；髂z(gelma)溶液混合，獲得含有乙酸乙酯與明膠溶液的混合液1及含有乙酸乙酯與甲基丙烯酰化明膠(gelma)溶液的混合液2，將所述混合液1及混合液2分別與大豆油混合，置于0-10℃凝膠化，以400-600rpm的轉(zhuǎn)速均勻攪拌20-40分鐘獲得含有顆粒的混合液1和混合液2；

10、步驟12、將混合液1和混合液2分別過(guò)濾，獲得顆粒1和顆粒2，并將所述顆粒1和顆粒2分散在預(yù)冷的-20℃的無(wú)水乙醇中，攪拌后靜置，倒掉上層乙醇，先后用二氧六環(huán)、丙酮和無(wú)水乙醇洗滌三次，過(guò)夜干燥，并經(jīng)過(guò)粒徑篩選，獲得干燥的明膠微球(gms)和未交聯(lián)的甲基丙烯?；髂z水凝膠微球(gmms)。

11、在某些實(shí)施例中，所述乙酸乙酯與所述明膠溶液的體積比為2：(3-5)，所述乙酸乙酯與所述甲基丙烯酰化明膠(gelma)溶液的體積比為2：(3-5)。

12、在某些實(shí)施例中，所述混合液1與大豆油的體積比為2：3，所述混合液2與大豆油的體積比為2：3。

13、在某些實(shí)施例中，所述粒徑篩選范圍為100-150μm。

14、在某些實(shí)施例中，所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bmp-2)溶液的濃度為0.8-1.5μg/ml；所述步驟2中低溫為3-5℃。

15、在某些實(shí)施例中，所述透明質(zhì)酸甲基丙烯酸酯(hama)溶液的濃度為1％-3％，所述hms/mbs水凝膠前體中g(shù)ms和gmbs的濃度均為以濕重計(jì)0.2-0.4g/ml。

16、在某些實(shí)施例中，所述hms/mbs/adscs復(fù)合水凝膠中所述脂肪來(lái)源干細(xì)胞(adscs)的濃度為4×106-6×106個(gè)細(xì)胞/毫升。

17、另一方面，本技術(shù)還提供了所述的制備方法制備獲得的hms/mbs/adscs復(fù)合水凝膠。

18、采用上述技術(shù)方案，該多孔透明質(zhì)酸甲基丙烯酸酯水凝膠，可以包裹脂肪源性干細(xì)胞(adipose-derived?stem?cells,adscs)與骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone?morphogeneticprotein-2,bmp-2)。明膠微球作為致孔劑構(gòu)建水凝膠內(nèi)部微孔結(jié)構(gòu)(hms)，而中空明膠甲基丙烯酰胺水凝膠微球則用于負(fù)載bmp-2(gmbs)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，adscs在該多孔水凝膠體系中呈現(xiàn)顯著增殖與定向遷移特性。將負(fù)載adscs的復(fù)合水凝膠(hms/mbs/adscs)應(yīng)用于大鼠肩袖損傷模型后，其有效重建了纖維軟骨過(guò)渡帶并促進(jìn)tbi愈合。

19、另一方面，本技術(shù)還提供了所述的hms/mbs/adscs復(fù)合水凝膠在制備增強(qiáng)tbi愈合和/或纖維軟骨過(guò)渡帶重建的骨質(zhì)修復(fù)支架中的應(yīng)用。

20、本技術(shù)相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)而言，具有以下技術(shù)效果。

21、1)成功制備出具備標(biāo)準(zhǔn)組織工程特征及雙重生物活性的生物材料hms/mbs/adscs復(fù)合水凝膠。該復(fù)合水凝膠內(nèi)部的多孔設(shè)計(jì)為細(xì)胞增殖提供了必要空間，有力地促進(jìn)了細(xì)胞的增殖和聚集。為進(jìn)一步提升材料的功能性，通過(guò)制備gelma微球負(fù)載bmp-2，并對(duì)多種負(fù)載方式進(jìn)行了系統(tǒng)對(duì)比研究，最終實(shí)現(xiàn)了更為優(yōu)異的緩釋效果。同時(shí)，基于該復(fù)合水凝膠提供的適宜環(huán)境以及bmp-2的誘導(dǎo)作用，adscs的旁分泌活性得以持續(xù)增強(qiáng)。

22、2)本技術(shù)證明了該生物材料hms/mbs/adscs復(fù)合水凝膠在大鼠肩袖損傷模型中顯著增強(qiáng)tbi愈合和纖維軟骨過(guò)渡帶重建。同時(shí)，深入探究了adscs旁分泌效應(yīng)對(duì)腱骨界面愈合的作用機(jī)制。體內(nèi)外分析均證實(shí)ampk和tgf-β/smad2/3信號(hào)通路在tbi修復(fù)中的關(guān)鍵作用：早期階段通過(guò)ampk通路清除ros并保護(hù)線粒體功能，后期通過(guò)tgf-β/smad2/3通路促進(jìn)纖維軟骨和肌腱再生。通過(guò)整合材料設(shè)計(jì)與機(jī)制探索，本技術(shù)不僅拓展了組織工程水凝膠的應(yīng)用潛力，也為臨床治療提供了新思路。