胍基乙酸(gaa)是用作動(dòng)物飼料添加劑的無(wú)色晶體狀有機(jī)化合物(例如wo2005120246?a1和us2011257075?a1)。gaa是肌酸的天然前體(例如humm等，biochem.j.(1997)322，771-776)。因此，gaa的補(bǔ)充允許生物體中肌酸的最佳供應(yīng)。本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化為能夠產(chǎn)生胍基乙酸(gaa)的微生物和使用此類(lèi)微生物發(fā)酵生產(chǎn)gaa的方法。本發(fā)明還涉及用于發(fā)酵生產(chǎn)肌酸的方法。
背景技術(shù)：
：：1、在生物系統(tǒng)中，gaa和鳥(niǎo)氨酸由精氨酸和甘氨酸作為起始材料通過(guò)l-精氨酸：甘氨酸-脒基轉(zhuǎn)移酶(agat；ec?2.1.4.1)的催化作用形成。此反應(yīng)也是肌酸生物合成的第一步。2、3、guthmiller等(j?biol?chem.1994jul?l；269(26)：17556-60)已通過(guò)克隆和異源表達(dá)大腸桿菌(e.coli)中的酶來(lái)表征大鼠腎agat。muenchhoff等(febs?journal?277(2010)3844-3860)也通過(guò)克隆和異源表達(dá)大腸桿菌中的酶報(bào)告了來(lái)自原核生物的agat的首次表征。4、fan?wenchao公開(kāi)了通過(guò)發(fā)酵非病原微生物如谷氨酸棒狀桿菌(corynebacteriumglutamicum)來(lái)生產(chǎn)肌酸的方法(cn106065411a)。微生物具有以下生物轉(zhuǎn)化功能：將葡萄糖轉(zhuǎn)換為l-谷氨酸；將l-谷氨酸轉(zhuǎn)換為n-乙酰-l-谷氨酸；將n-乙酰-l-谷氨酸轉(zhuǎn)換為n-乙酰-l-谷氨酸半醛；將n-乙酰-l-谷氨酸半醛轉(zhuǎn)換為n-乙酰-l-鳥(niǎo)氨酸；將n-乙酰-l-鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)換為l-鳥(niǎo)氨酸；將l-鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)換為l-瓜氨酸；將l-瓜氨酸轉(zhuǎn)換為精氨酸-琥珀酸；將精氨酸-琥珀酸轉(zhuǎn)換為l-精氨酸；將l-精氨酸轉(zhuǎn)換為胍基乙酸；以及最后將胍基乙酸轉(zhuǎn)換為肌酸。fanwenchao提出，微生物過(guò)表達(dá)一種或多種選自n-乙酰谷氨酸-合酶、n-乙酰鳥(niǎo)氨酸-δ-氨基轉(zhuǎn)移酶、n-乙酰鳥(niǎo)氨酸酶、鳥(niǎo)氨酸-氨甲?；D(zhuǎn)移酶、精氨基琥珀酸合成酶、甘氨酸脒基轉(zhuǎn)移酶(ec：2.1.4.1)和胍基乙酸n-甲基轉(zhuǎn)移酶(ec：2.1.1.2)的酶。微生物過(guò)表達(dá)優(yōu)選甘氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(l-精氨酸：甘氨酸脒基轉(zhuǎn)移酶)和胍基乙酸n-甲基轉(zhuǎn)移酶。5、zhang等發(fā)表了能夠生產(chǎn)胍基乙酸(gaa)的微生物(acs?synth.biol.2020，9，2066-275)。他們通過(guò)從不同物種(例如智人、拉氏擬柱孢藻(cylindrospermopsisraciborskii)、moorea?producens)引入異源agat并通過(guò)將瓜氨酸合成組件(例如argf和argi的過(guò)表達(dá))和精氨酸合成組件(例如argg、argh的過(guò)表達(dá)；aspa的引入)引入大腸桿菌中來(lái)設(shè)計(jì)大腸桿菌中的重組鳥(niǎo)氨酸循環(huán)。6、schneider和jankowitsch(wo2021122400?a1)提出使用具有編碼具有l(wèi)-精氨酸：甘氨酸脒基轉(zhuǎn)移酶(agat)的功能的蛋白質(zhì)的基因和增加的氨甲酰磷酸酯合成酶的微生物生產(chǎn)gaa的方法。氨甲酰磷酸酯是gaa生物合成的重要前體，但也是l-精氨酸和其它化合物的生物合成的重要前體。7、為了增加使用微生物的gaa生產(chǎn)，需要細(xì)胞內(nèi)大量的起始材料精氨酸和/或甘氨酸。同時(shí)，agat反應(yīng)的副產(chǎn)物l-鳥(niǎo)氨酸必須有效地再循環(huán)至l-精氨酸，以防止碳和能量的損失。8、從文獻(xiàn)中還已知用于增加微生物中g(shù)aa合成的起始材料中的一種(即l-精氨酸)的產(chǎn)生的數(shù)種途徑。park等人(nature?communications|doi：10.1038/ncomms5618)提供了用于l-精氨酸產(chǎn)生的谷氨酸棒狀桿菌(c.glutamicum)的代謝工程的綜述。yim等人(j?indmicrobiol?biotechnol(2011)38：1911-1920)可以顯示，通過(guò)破壞谷氨酸棒狀桿菌中的染色體argr基因，編碼控制l-精氨酸生物合成途徑的中心阻遏蛋白argr的argr基因的失活導(dǎo)致改善的精氨酸產(chǎn)生菌株。ginesy等人(microbial?cell?factories(2015)14：29)報(bào)告了大腸桿菌的成功工程化以增強(qiáng)精氨酸產(chǎn)生。其中，他們提出了argr阻遏基因的缺失。9、另一方面，還需要增加的胞內(nèi)甘氨酸濃度以增加gaa的產(chǎn)生。這通過(guò)甘氨酸的內(nèi)部合成實(shí)現(xiàn)?；蛘?，可將甘氨酸添加到培養(yǎng)基中，且膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白促進(jìn)攝取。10、來(lái)自大腸桿菌的cyca已被表征為d-丙氨酸、d-絲氨酸、甘氨酸、l-丙氨酸、d-環(huán)絲氨酸(robbins73、cosloy73)和β-丙氨酸的次級(jí)、h+依賴(lài)性攝取轉(zhuǎn)運(yùn)子(schneider等人，appl?microbiol?biotechnol.2004oct；65(5)：576-82.doi：10.1007/s00253-004-1636-0.epub?2004jun?24.pmid：15221223)。此外，pulvermacher等人(microbiology(2009)，155，106-114；doi?10.1099/mic.0.023598-0)報(bào)告在大腸桿菌中，cyca基因編碼通透酶，其用于將d-丙氨酸、d-絲氨酸和甘氨酸運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞中。hook等人(microorganisms.2022mar17；10(3)：647.doi：10.3390/microorganisms10030647)。發(fā)現(xiàn)α-氨基丁酸、正纈氨酸和l-纈氨酸也是cyca的底物，并且cyca的過(guò)表達(dá)通過(guò)減少不需要的副產(chǎn)物的形成提高l-異亮氨酸的產(chǎn)量。11、對(duì)來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌atcc13032(seq?id?no：4)的cyca蛋白和大腸桿菌(e.coli)mg1655蛋白的blast搜索顯示，谷氨酸棒狀桿菌的cyca與大腸桿菌的cyca(＝b4208)66％相同。12、來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌的cyca基因(＝ncgl0453＝cg0555＝cgl0470＝cgl_rs02385＝daga；seq?id?no：3)可能編碼屬于“氨基酸-聚胺-有機(jī)陽(yáng)離子(apc)超家族(tc.2.a.3)”的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(saier等人，nucleic?acids?res.2021jan?8；49(d1)：d461-d467.doi：10.1093/nar/gkaa1004)。在谷氨酸棒狀桿菌atcc13032的基因組序列中，cyca產(chǎn)品被注釋為d-絲氨酸/d-丙氨酸/甘氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)子(genbank登錄號(hào)nc_003450，基因座_標(biāo)簽＝“cgl_rs02385”；還參見(jiàn)kalinowski等人，2003，j?biotechnol?104：5-25.10.1016/s0168-1656(03)00154-8)。然而，cyca蛋白還沒(méi)有被生物化學(xué)表征，因此其在谷氨酸棒狀桿菌中的功能未知。技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路1、本發(fā)明潛在的問(wèn)題是提供轉(zhuǎn)化為能夠以更高的量產(chǎn)生胍基乙酸(gaa)的微生物和使用此類(lèi)微生物產(chǎn)生gaa的方法。2、該問(wèn)題由包含至少一種編碼具有l(wèi)-精氨酸：甘氨酸脒基轉(zhuǎn)移酶(agat，例如ec2.1.4.1)功能的蛋白的異源基因，并具有過(guò)表達(dá)的編碼跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因的微生物解決，所述跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有與根據(jù)seq?id?no：4的序列具有至少50％相同性的氨基酸序列?？缒まD(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列可以與根據(jù)seq?id?no：4的序列至少50％、66％、70％、80％或90％相同。優(yōu)選地，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列與根據(jù)seq?id?no：4的序列至少66％相同，更優(yōu)選與根據(jù)seq?id?no：4的序列相同。3、seq?id?no：3示出了相應(yīng)cyca基因的核苷酸序列。seq?id?no：4是谷氨酸棒狀桿菌的cyca蛋白的氨基酸序列。4、谷氨酸棒狀桿菌的cyca蛋白是屬于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的“氨基酸-聚胺-有機(jī)陽(yáng)離子超家族(tc.2.a.3)”的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(saier?mh，reddy?vs，moreno-hagelsieb?g，hendargo?kj，zhang?y，iddamsetty?v，lam?kjk，tian?n，russum?s，wang?j，medrano-soto?a.“thetransporter?classification?database(tcdb)：2021update.”nucleic?acidsres.2021jan8；49(d1)：d461-d467.doi：10.1093/nar/gkaa1004).。5、本發(fā)明上下文中的微生物是微觀尺寸的生物體，其可以以單細(xì)胞形式或作為細(xì)胞集落存在。微生物包括大多數(shù)來(lái)自所有三個(gè)生命域的單細(xì)胞生物。域古生菌和細(xì)菌僅包括微生物。在第三域真核單細(xì)胞生物如酵母中，原生生物和原生動(dòng)物屬于微生物的組。在本發(fā)明的上下文中，多細(xì)胞生物體或其部分，如細(xì)胞培養(yǎng)物，特別是動(dòng)物細(xì)胞(例如人細(xì)胞)的培養(yǎng)物，不被認(rèn)為是微生物。在本發(fā)明的上下文中，動(dòng)物細(xì)胞(例如人細(xì)胞)明確地排除在微生物的定義之外。6、根據(jù)本發(fā)明的微生物能夠在不向生產(chǎn)培養(yǎng)基中添加甘氨酸的情況下以更高的量產(chǎn)生gaa。7、異源基因意指該基因已插入不天然具有此基因的宿主生物體中。在宿主中插入異源基因通過(guò)重組dna技術(shù)進(jìn)行。已經(jīng)歷重組dna技術(shù)的微生物稱(chēng)為轉(zhuǎn)基因的、遺傳修飾的或重組的。異源蛋白意指不天然存在于微生物中的蛋白。同源或內(nèi)源基因意指基因(包括其本身的功能)或基因的核苷酸序列在微生物中天然存在或在微生物中是“天然的”。同源或天然蛋白意指天然存在于微生物中的蛋白。8、在根據(jù)本發(fā)明的微生物中，與野生型生物中相應(yīng)的活性相比，具有l(wèi)-精氨酸：甘氨酸脒基轉(zhuǎn)移酶(agat)功能的蛋白的活性?xún)?yōu)選增加。優(yōu)選地，通過(guò)編碼具有l(wèi)-精氨酸：甘氨酸脒基轉(zhuǎn)移酶功能的蛋白的基因的過(guò)表達(dá)來(lái)增加agat活性。9、在根據(jù)本發(fā)明的微生物中，具有l(wèi)-精氨酸：甘氨酸脒基轉(zhuǎn)移酶(agat)功能的蛋白包含與根據(jù)seq?id?no：2的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列。10、基因的過(guò)表達(dá)通常通過(guò)增加基因的拷貝數(shù)和/或通過(guò)將基因功能性連接至強(qiáng)啟動(dòng)子和/或通過(guò)增強(qiáng)核糖體結(jié)合位點(diǎn)和/或通過(guò)起始密碼子或整個(gè)基因的密碼子使用優(yōu)化和/或通過(guò)修飾調(diào)控基因表達(dá)的蛋白的活性或包括上述所有方法的選擇的組合來(lái)實(shí)現(xiàn)。11、啟動(dòng)子是由約40-50個(gè)堿基對(duì)組成的dna序列，其構(gòu)成rna聚合酶全酶的結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，由此可以影響被控制的多核苷酸或基因的表達(dá)強(qiáng)度。通常，可以通過(guò)選擇強(qiáng)啟動(dòng)子來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)菌中基因表達(dá)的過(guò)表達(dá)或增加，例如通過(guò)用強(qiáng)的天然(最初分配給其它基因)啟動(dòng)子代替原先的啟動(dòng)子或通過(guò)將給定的天然啟動(dòng)子的某些區(qū)域(例如其所謂的-10和-35區(qū))修飾至共有序列，例如由m.patek等人(microbial?biotechnology?6(2013)，103-117)針對(duì)谷氨酸棒狀桿菌所教導(dǎo)的?！皬?qiáng)”啟動(dòng)子的實(shí)例是超氧化物歧化酶(sod)啟動(dòng)子(“psod”；z.wang等人，eng.life?sci.2015,15,73-82)?！肮δ苄赃B接”被理解為意指導(dǎo)致基因的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子與基因的順序布置。12、在本上下文中，蛋白序列相關(guān)的程度表示為相同性，其更具體地意為根據(jù)作為百分比給出的同源搜索(blast?search)的結(jié)果序列中有多少是相同的(參見(jiàn)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/nbk62051/作為定義)。13、與野生型微生物的能力相比，根據(jù)本發(fā)明的微生物可具有增加的從l-鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)生l-精氨酸的能力。14、在本發(fā)明的上下文中，具有提高的產(chǎn)生l-精氨酸的能力的微生物意指產(chǎn)生l-精氨酸超過(guò)其自身需要的微生物。此類(lèi)產(chǎn)生l-精氨酸的細(xì)菌的實(shí)例是例如谷氨酸棒狀桿菌atcc21831或park等人(nature?communications|doi：10.1038/ncomms5618)或ginesy等人(microbial?cell?factories(2015)14：29)公開(kāi)的那些。與以前描述的具有增加的產(chǎn)生l-精氨酸的能力的細(xì)菌相比，在用于gaa產(chǎn)生的菌株中l(wèi)-精氨酸分泌是不必要的，因?yàn)樵诒景l(fā)明的框架中細(xì)胞內(nèi)部利用精氨酸用于gaa產(chǎn)生。15、在根據(jù)本發(fā)明的微生物進(jìn)一步的實(shí)施方案中，與野生型微生物中的argr基因的表達(dá)相比，編碼精氨酸響應(yīng)阻遏蛋白argr的argr基因的表達(dá)減弱?；蛘撸琣rgr基因缺失。16、本發(fā)明的微生物可屬于棒狀桿菌屬(genus?corynebacterium)、桿菌屬(genusbacillus)(yan，k.等人(2022),biosynthesis?of?guanidinoacetate?by?bacillussubtilis?whole-cell?catalysis.fermentation?8(3)：116))、腸桿菌屬(genusenterobacteriaceae)或假單胞菌屬(genus?pseudomonas)。17、在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，微生物是谷氨酸棒狀桿菌(c.glutamicum)或大腸桿菌(e.coli)。18、本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于發(fā)酵生產(chǎn)胍基乙酸(gaa)的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的微生物和在培養(yǎng)基中積累gaa以形成含有g(shù)aa的發(fā)酵液的步驟。19、根據(jù)本發(fā)明的方法可進(jìn)一步以為不向培養(yǎng)基中加入甘氨酸為特征。20、優(yōu)選地，該方法進(jìn)一步包括從含有g(shù)aa的發(fā)酵液中分離gaa。21、在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的微生物進(jìn)一步包含編碼具有胍基乙酸n-甲基轉(zhuǎn)移酶活性的酶的基因。編碼具有胍基乙酸n-甲基轉(zhuǎn)移酶活性的酶的基因可為過(guò)表達(dá)的。22、本發(fā)明還涉及用于發(fā)酵生產(chǎn)肌酸的方法，包括以下步驟：a)在合適的條件下在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的微生物，所述微生物進(jìn)一步包含編碼具有胍基乙酸n-甲基轉(zhuǎn)移酶活性的酶的基因，和b)在培養(yǎng)基中積累肌酸以形成含有肌酸的發(fā)酵液。23、優(yōu)選地，該方法進(jìn)一步包括從含有肌酸的發(fā)酵液中分離肌酸?？梢酝ㄟ^(guò)等電點(diǎn)法和/或離子交換法從發(fā)酵液提取肌酸?；蛘撸梢酝ㄟ^(guò)在水中重結(jié)晶的方法進(jìn)一步純化肌酸。24、序列的簡(jiǎn)要說(shuō)明25、seq?id?no：1：編碼moorena?producens的l-精氨酸：甘氨酸脒基轉(zhuǎn)移酶(agat_mp，ec2.1.4.1；locus_tag?bjp34_00300)的開(kāi)放閱讀框。26、seq?id?no：2：衍生的agat_mp氨基酸序列(genbank登錄號(hào)wp_070390602)27、seq?id?no：3：谷氨酸棒狀桿菌atcc13032的開(kāi)放閱讀框ncgl0453(＝cyca)(ncbi參考序列：nc_003450.3)28、seq?id?no：4：ncgl0453的衍生氨基酸序列(＝cyca)(ncbi參考序列：wp_231838291.1)29、seq?id?no：5：定制用于基因合成的agat-mp插入30、seq?id?no：6：大腸桿菌-谷氨酸棒狀桿菌穿梭質(zhì)粒plib_p31、seq?id?no：7：pcr引物cyca_f_noti32、seq?id?no：8：pcr引物cyca_r_noti33、seq?id?no：9：pcr引物dargr_lf34、seq?id?no：10：pcr引物dargr_lr35、seq?id?no：11：pcr引物dargr_rf36、seq?id?no：12：pcr引物dargr_rr37、實(shí)施例38、a)材料和方法39、化學(xué)品40、來(lái)自卡那鏈霉菌(streptomyces?kanamyceticus)的卡那霉素溶液購(gòu)自sigmaaldrich(st.louis，usa，cat.no.k0254)。如果沒(méi)有另外說(shuō)明，所有其它化學(xué)品從merck(darmstadt，germany)、sigma?aldrich(st.louis，usa)或carl-roth(karlsruhe，germany)以分析純購(gòu)買(mǎi)。41、用于細(xì)胞增殖的培養(yǎng)42、如果沒(méi)有另外說(shuō)明，培養(yǎng)/孵育程序如下進(jìn)行：43、a.來(lái)自merck(darmstadt，germany；cat.no.110285)的lb肉湯(miller)用于在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌菌株。將液體培養(yǎng)物(10ml液體培養(yǎng)基/具有3個(gè)隔板的100mlerlenmeyer)在30℃和200rpm下在來(lái)自infors?gmbh(bottmingen，switzerland)的inforsht?multitron標(biāo)準(zhǔn)振蕩培養(yǎng)箱中孵育。44、b.來(lái)自merck(darmstadt，germany，cat.no.110283)的lb瓊脂(miller)用于在瓊脂平板上培養(yǎng)大腸桿菌菌株。在30℃下在來(lái)自vwr(radnor，usa)的incu-微型培養(yǎng)箱中孵育瓊脂平板。45、c.來(lái)自merck(darmstadt，germany，cat.no.110493)的腦心浸液(bhi)用于在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)谷氨酸棒狀桿菌菌株。將液體培養(yǎng)物(10ml液體培養(yǎng)基/具有3個(gè)隔板的100mlerlenmeyer)在30℃和200rpm下在來(lái)自infors?gmbh(bottmingen，switzerland)的inforsht?multitron標(biāo)準(zhǔn)振蕩培養(yǎng)箱中孵育。46、d.來(lái)自merck(darmstadt，germany，cat.no.113825)的腦心瓊脂(bhi-瓊脂)用于在瓊脂平板上培養(yǎng)谷氨酸棒狀桿菌菌株。將瓊脂板在30℃下在來(lái)自heraeus?instruments的培養(yǎng)箱中用溫度控制器(hanau，germany)孵育。47、e.為了在電穿孔后培養(yǎng)谷氨酸棒狀桿菌，向bhi-瓊脂(merck,darmstadt,germany,cat.no.113825)補(bǔ)充134g/l山梨醇(carl?roth?gmbh+co.kg，karlsruhe，germany)、2.5g/l酵母提取物(oxoid/thermofisher?scientific，waltham，usa，cat.no.lp0021)和25mg/l卡那霉素。將瓊脂板在30℃下在來(lái)自heraeus?instruments的培養(yǎng)箱中用溫度控制器(hanau，germany)孵育。48、測(cè)定細(xì)菌懸浮液的光密度49、a.使用來(lái)自eppendorf?ag(hamburg，germany)的bio-photometer在600nm(od600)下測(cè)定搖瓶培養(yǎng)物中細(xì)菌懸浮液的光密度。50、b.在wouter?duetz(wds)微發(fā)酵系統(tǒng)(24-孔板)中產(chǎn)生的細(xì)菌懸浮液的光密度用來(lái)自tecan?group?ag(switzerland)的geniostm板讀數(shù)器在660nm(od660)下測(cè)定。51、離心52、a.使用eppendorf?5417r臺(tái)式離心機(jī)在1.5ml或2ml反應(yīng)管(例如eppendorf3810x)中對(duì)最大體積2ml的細(xì)菌懸浮液進(jìn)行離心(5分鐘，13,000rpm)。53、b.使用eppendorf?5810r臺(tái)式離心機(jī)在15ml或50ml離心管(例如falcontm?50mlconical?centrifuge?tubes)中對(duì)最大體積50ml的細(xì)菌懸浮液以4,000rpm離心10分鐘。54、dna分離55、根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，使用來(lái)自qiagen(hilden，germany，cat.no.27106)的qiaprep?spin?miniprep?kit從大腸桿菌細(xì)胞中分離質(zhì)粒dna。56、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)57、使用帶有校對(duì)(高精確性)聚合酶的pcr擴(kuò)增dna的期望的區(qū)段用于測(cè)序或dna組裝。非校對(duì)聚合酶試劑盒用于直接從大腸桿菌或谷氨酸棒狀桿菌菌落確定期望的dna片段的存在或不存在。58、a.根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)(參見(jiàn)表1)，使用來(lái)自new?england?biolabs?inc.(ipswich，usa，cat.no.m0530)的high-fidelity?dna?polymerase?kit(phusionkit)對(duì)選擇的dna區(qū)域進(jìn)行模板-校正擴(kuò)增。59、60、表1：用來(lái)自new?england?biolabs?inc.的high-fidelity?dnapolymerase?kit進(jìn)行的pcr的熱循環(huán)條件。61、b.使用來(lái)自qiagen(hilden，germany，cat.no.201203)的taq?pcr?core?kit(taqkit)擴(kuò)增dna的期望的區(qū)段以確認(rèn)其存在。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)使用試劑盒(參見(jiàn)表2)。62、63、表2：使用來(lái)自qiagen的taq?pcr?core?kit(taq試劑盒)進(jìn)行的pcr的熱循環(huán)條件。64、c.根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)使用來(lái)自takara?bio?inc(takara?bio?europe?s.a.s.，saint-germain-en-layye，france，cat.no.rr350a/b)的fast?pcr?mastermix(sapphire?mix)作為確認(rèn)在取自大腸桿菌或谷氨酸棒狀桿菌菌落的細(xì)胞中存在期望的dna區(qū)段的替代方案(參見(jiàn)表3)。65、66、67、表3：使用來(lái)自takara?bio?inc.的fast?pcr?master?mix(sapphiremix)進(jìn)行的pcr的熱循環(huán)條件68、d.所有寡核苷酸引物由eurofins?genomics?gmbh(ebersberg，germany)合成。69、e.作為pcr模板，使用分離的質(zhì)粒dna或與從液體培養(yǎng)物分離的總dna或細(xì)菌菌落中含有的總dna(菌落pcr)的適當(dāng)稀釋的溶液。對(duì)于所述菌落pcr，通過(guò)用無(wú)菌牙簽從瓊脂板上的菌落取細(xì)胞材料并將細(xì)胞材料直接放入pcr反應(yīng)管中制備模板。在來(lái)自severin?gmbh(sundern，germany)的微波爐類(lèi)型mikrowave&grill中用800w加熱細(xì)胞材料10秒，然后將pcr試劑添加到pcr反應(yīng)管中的模板中。70、f.所有pcr反應(yīng)在來(lái)自eppendorf?ag(hamburg，germany)的pcr?cycler類(lèi)型mastercycler或mastercycler聯(lián)結(jié)梯度(nexus?gradient)中進(jìn)行。71、dna的限制性酶消化72、對(duì)于限制性酶消化，使用“fastdigest限制性?xún)?nèi)切核酸酶(fd)”(thermofisherscientific，waltham，usa)或來(lái)自new?england?biolabs?inc.(ipswich，usa)的限制性?xún)?nèi)切核酸酶。根據(jù)制造商手冊(cè)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反應(yīng)。73、確定dna片段的大小74、a.通常通過(guò)使用來(lái)自qiagen(hilden，germany)的qiaxcel的自動(dòng)毛細(xì)管電泳來(lái)確定小dna片段(<1000bp)的尺寸。75、b.如果需要分離dna片段，或者如果dna片段>1000bp，則dna通過(guò)tae瓊脂糖凝膠電泳分離，并用nucleic?acid?gel?stain(biotium，inc.，fremont，canada)染色。染色的dna在302nm處可視化。76、pcr擴(kuò)增和限制性片段的純化77、根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，使用來(lái)自qiagen(hilden，germany；cat.no.28106)的qiaquick?pcr?purification?kit清理pcr擴(kuò)增片段和限制性片段。用30μl?10mm?tris*hcl(ph8.5)洗脫dna。78、確定dna濃度79、使用來(lái)自2015vwr品牌(erlangen，germany)的peqlab?biotechnologie?gmbh的nanodrop分光光度計(jì)nd-1000測(cè)量dna濃度。80、組裝克隆81、使用購(gòu)自new?england?biolabs?inc.(ipswich，usa，cat.no.e5520)的“nebuilder?hifi?dna?assembly?cloning?kit”組裝質(zhì)粒載體。將含有線性載體和至少一個(gè)dna插入物的反應(yīng)混合物在50℃下孵育60分鐘。每個(gè)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)使用0.5μl的組裝混合物。82、大腸桿菌的化學(xué)轉(zhuǎn)化83、對(duì)于質(zhì)?？寺?，根據(jù)制造商的方案轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)的“stable?competente.coli(高效)”(new?england?biolabs?inc.，ipswich，usa，cat.no.c3040)。在補(bǔ)充有25mg/l卡那霉素的lb瓊脂上選擇成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。84、谷氨酸棒狀桿菌的轉(zhuǎn)化85、如ruan等人(2015)所述，使用gene?pulser?xcell“(bio-rad?laboratoriesgmbh，feldkirchen，germany)通過(guò)電穿孔進(jìn)行用質(zhì)粒-dna對(duì)谷氨酸棒狀桿菌的轉(zhuǎn)化。電穿孔在1mm電穿孔比色皿(bio-rad?laboratories?gmbh，feldkirchen，germany)中以1.8kv和設(shè)定為5ms的固定時(shí)間常數(shù)進(jìn)行。在含有134g/l山梨糖醇、2.5g/l酵母提取物和25mg/l卡那霉素的bhi-瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞。86、谷氨酸棒狀桿菌菌株87、谷氨酸棒狀桿菌野生型菌株谷氨酸棒狀桿菌atcc13032(dsm?20300，kinoshitas，udaka?s，shimono?m.，j.gen.appl.microbiol.1957；3(3)：193-205)在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc)或在微生物和細(xì)胞培養(yǎng)gmbh的dsmz-german?collection可商購(gòu)。88、確定核苷酸序列89、dna分子的核苷酸序列使用sanger等人的雙脫氧鏈終止方法(proceedings?ofthe?national?academy?of?sciences?usa?74，5463-5467，1977)通過(guò)eurofins?genomicsgmbh(ebersberg，germany)通過(guò)循環(huán)測(cè)序測(cè)定。使用來(lái)自scientific&educationalsoftware(denver，usa)的克clonemanager?professional?9軟件可視化和評(píng)價(jià)序列以及序列的計(jì)算機(jī)組裝。90、大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌菌株的甘油原液(stocks)91、為長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存，制備了大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌的甘油原液。選擇的大腸桿菌克隆在補(bǔ)充有2g/l葡萄糖的10ml?lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在補(bǔ)充有2g/l葡萄糖的10ml雙重濃縮bhi培養(yǎng)基中培養(yǎng)選擇的谷氨酸棒狀桿菌克隆。用25mg/l卡那霉素補(bǔ)充含大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌菌株的用于生長(zhǎng)質(zhì)粒的培養(yǎng)基。在具有3個(gè)隔板的100ml?erlenmeyer中含有培養(yǎng)基。培養(yǎng)基用取自集落的細(xì)胞環(huán)接種。然后將培養(yǎng)物在30℃和200rpm下孵育18小時(shí)。在所述孵育期之后，將1.2ml?85％(v/v)無(wú)菌甘油加入培養(yǎng)物中。然后將獲得的含有甘油的細(xì)胞懸浮液以2ml份等分并儲(chǔ)存在-80℃。92、小規(guī)模培養(yǎng)中的gaa生產(chǎn)93、使用根據(jù)duetz(2007)的升-規(guī)模(millilitre-scale)培養(yǎng)系統(tǒng)評(píng)估菌株的gaa-產(chǎn)生。為此目的，使用填充有每孔2.5ml培養(yǎng)基的來(lái)自enzyscreen?bv(heemstede，netherlands，cat.no.cr1424)的24-深孔微板(24孔wds板)。94、菌株的預(yù)培養(yǎng)在10ml種子培養(yǎng)基(sm)中進(jìn)行。在具有3個(gè)隔板的100mlerlenmeyer中含有培養(yǎng)基。培養(yǎng)基用100μl的甘油原液培養(yǎng)物接種，并將培養(yǎng)物在30℃和200rpm下孵育24小時(shí)。種子培養(yǎng)基(sm)的組成在表4中示出。95、 成分 濃度(g/l) 酵母提取物fm902(angel?yeast?co.,ltd，hubei，p.r.china) 10 尿素 1.5 <![cdata[kh₂po₄]]> 0.5 <![cdata[k₂hpo₄]]> 0.5 <![cdata[mgso₄*7h₂o]]> 1 生物素 0.0001 鹽酸硫胺素 0.0001 <![cdata[feso₄*7h₂o]]> 0.01 <![cdata[mnso₄*h₂o]]> 0.01 葡萄糖 20 卡那霉素 0.025 ph＝7.0 ? 96、表4：種子培養(yǎng)基(sm)97、在所述孵育期之后，確定預(yù)培養(yǎng)物的光密度od600。從預(yù)培養(yǎng)物中取樣接種2.5ml生產(chǎn)培養(yǎng)基(pm)至0.1的od600所需的體積，離心(在8000g下1分鐘)并棄去上清液。然后將細(xì)胞重懸于100μl的生產(chǎn)培養(yǎng)基中。98、通過(guò)用100μl來(lái)自預(yù)培養(yǎng)物的重懸細(xì)胞接種每個(gè)含有2.4ml生產(chǎn)培養(yǎng)基(pm)的24孔wds-板的孔來(lái)啟動(dòng)主要培養(yǎng)物。生產(chǎn)培養(yǎng)基(pm)的組成在表5中示出。99、 成分 濃度(g/l) 3-(n-嗎啉代)丙磺酸(mops) 40 酵母提取物fm902(angel?yeast?co.，ltd，hubei，p.r.china) 1.5 <![cdata[(nh₄)₂so₄]]> 10 <![cdata[nh₄cl]]> 15 <![cdata[檸檬酸三鈉*2h₂o]]> 10 urea 1 <![cdata[kh₂po₄]]> 0.5 <![cdata[k₂hpo₄]]> 0.5 醋酸銨 7.7 <![cdata[mgso₄*7h₂o]]> 1 生物素 0.0001 鹽酸硫胺素 0.0001 <![cdata[feso₄*7h₂o]]> 0.01 <![cdata[mnso₄*h₂o]]> 0.01 <![cdata[znso₄*7h₂o]]> 0.00002 <![cdata[cuso₄*5h₂o]]> 0.0004 止泡劑xfo-1501(ivanhoe?industries?inc.，zion，usa) 0.5 葡萄糖 40 l-精氨酸 1.9 卡那霉素 0.025 ph＝7.2 ? 100、表5：生產(chǎn)培養(yǎng)基(pm)101、將主要培養(yǎng)物在來(lái)自infors?gmbh(bottmingen，switzerland)的infors?htmultitron標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱搖床中在30℃和225rpm下孵育72小時(shí)直至完全消耗葡萄糖。用來(lái)自lifescan(johnson&johnson?medical?gmbh，neuss，germany)的血糖儀onetouch?分析懸浮液中的葡萄糖濃度。102、培養(yǎng)后，將培養(yǎng)懸浮液轉(zhuǎn)移至深孔微板。適當(dāng)稀釋部分培養(yǎng)物懸浮液以測(cè)量od600。將培養(yǎng)物的另一部分離心，并如下所述分析上清液中g(shù)aa的濃度。103、gaa的定量104、用由與質(zhì)量分析器“triple?quad?6420”(agilent?technologies?inc.，santaclara，usa)連接的hplc“infinity?1260”組成的來(lái)自agilent的分析系統(tǒng)分析樣品。在35℃下在atlantis?hilic?silica柱，4.6×250mm，5μm(waters?corporation，milford，usa)上進(jìn)行色譜分離。流動(dòng)相a是含10mm甲酸銨和0.2％甲酸的水。流動(dòng)相b是90％乙腈和10％水的混合物，向混合物中加入10mm甲酸銨。hplc系統(tǒng)以100％b開(kāi)始，接著線性梯度22分鐘以及恒定流速0.6ml/min至66％b。質(zhì)量分析儀在esi正電離模式下操作。為了檢測(cè)gaa，通過(guò)使用mrm碎裂(fragmentation)[m+h]+118-76監(jiān)測(cè)m/z值。gaa的定量限(loq)固定為7ppm。105、b)實(shí)驗(yàn)結(jié)果106、實(shí)施例1：來(lái)自moorena?producens的編碼l-精氨酸：甘氨酸脒基轉(zhuǎn)移酶(agat，ec2.1.4.1)的基因agat-mp的克隆107、moorena?producens是絲狀藻青菌。moorena?producens菌株pal-8-15-08-1的基因組由leo等人(leo?t，castao?g，korobeynikov?a，monroeea，podell?s，glukhov?e，allenee，gerwick?wh，gerwick?l，proc?natl?acad?sci?usa.2017mar?21；114(12)：3198-3203.doi：10.1073/pnas；1618556114；genbank登記號(hào)cp017599.1)公開(kāi)。其含有編碼l-精氨酸：甘氨酸脒基轉(zhuǎn)移酶(agat，ec2.1.4.1；seq?id?no：1中所示的locus_tag?bjp34_00300)的開(kāi)放閱讀框。seq?id?no：2示出了衍生的氨基酸序列(genbank登錄號(hào)wp_070390602)。108、使用軟件工具“optimizer”(http：//genomes.urv.es/optimizer/)”將氨基酸序列翻譯回針對(duì)谷氨酸棒狀桿菌的密碼子使用而優(yōu)化的dna序列。用bsai限制位點(diǎn)、用于組裝克隆的5'-utr序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)擴(kuò)增優(yōu)化的基因的5'端。在3’端添加第二終止密碼子、用于組裝克隆的序列和bsai位點(diǎn)。所得dna序列命名為agat-mp-插入物(seq?id?no：5)，其被定制以從eurofins?genomics?gmbh(ebersberg，germany)進(jìn)行基因合成，并將其作為具有氨芐青霉素抗性基因的克隆質(zhì)粒(標(biāo)示為pex-a258_agat-mp)的一部分遞送。109、大腸桿菌-谷氨酸棒狀桿菌穿梭質(zhì)粒plib_p由pbl1復(fù)制起點(diǎn)(對(duì)于谷氨酸棒狀桿菌)、psc101復(fù)制起點(diǎn)(對(duì)于大腸桿菌)和卡那霉素抗性基因組成。在獨(dú)特的noti限制位點(diǎn)之后其具有強(qiáng)啟動(dòng)子、兩個(gè)反向定向的bsai位點(diǎn)和biobricks終止子bba_b1006(seq?id?no：6)。110、使用限制性?xún)?nèi)切核酸酶bsai消化plib_p，并且用“qiaquick?pcr?purificationkit”(qiagen?gmbh，hilden，germany)純化dna。111、使用限制性?xún)?nèi)切核酸酶bsai消化克隆質(zhì)粒pex-a258_agat-mp，并且用“qiaquickpcr?purification?kit”(qiagen?gmbh，hilden，germany)純化dna。112、將bsai消化的plib_p和pex-a258_agat-mp的dna溶液合并，并使用“nebuilderhifi?dna?assembly?cloning?kit”(new?england?biolabs?inc.，ipswich，usa，目錄號(hào)e5520)組裝匹配序列末端。將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為neb穩(wěn)定的感受態(tài)大腸桿菌(高效率)“(newengland?biolabs，ipswich，usa)，并在含有25mg/l卡那霉素的lb瓊脂上生長(zhǎng)細(xì)胞。通過(guò)限制性消化和dna測(cè)序鑒定合適的質(zhì)?？寺?。所得質(zhì)粒命名為plib_p_agat-mp。113、實(shí)施例2：編碼來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌的cyca(ncgl0453)和來(lái)自moorena?producens的l-精氨酸：甘氨酸脒基轉(zhuǎn)移酶(agat，ec?2.1.4.1)的表達(dá)質(zhì)粒plib_cyca_agat-mp的克隆：114、表達(dá)質(zhì)粒plib_cyca_agat-mp含有來(lái)自位于agat-mp基因上游的來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌的cyca基因(ncgl0453)及其啟動(dòng)子。115、使用引物cyca_f_noti(seq?id?no：7)和cyca_r_noti(seq?id?no：8)和谷氨酸棒狀桿菌atcc13032的基因組dna作為模板進(jìn)行pcr。所得pcr產(chǎn)物含有cyca基因(ncgl0453)加上ata起始密碼子上游的72bp序列。其使用“qiaquick?pcr?purification?kit”(qiagengmbh，hilden，germany)純化。116、使用限制性?xún)?nèi)切核酸酶noti消化質(zhì)粒plib_p_agat-mp，并且用“qiaquick?pcrpurification?kit”(qiagen?gmbh，hilden，germany)純化dna。117、將noti-消化的plib_p_agat-mp的dna與含有cyca的pcr產(chǎn)物合并，并使用“nebuilder?hifi?dna?assembly?cloning?kit”(new?england?biolabs?inc.，ipswich，usa，cat.no.e5520)組裝匹配序列末端。118、將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為“stable?competent?e.coli(高效)”(new?england?biolabs，ipswich，usa)，并在含有25mg/l卡那霉素的lb瓊脂上生長(zhǎng)細(xì)胞。通過(guò)限制性消化和dna測(cè)序鑒定合適的質(zhì)?？寺?。所得質(zhì)粒命名為plib_p_agat-mp。119、實(shí)施例3：atcc13032中基因argr的染色體缺失120、為了改善來(lái)自l-鳥(niǎo)氨酸的細(xì)胞內(nèi)l-精氨酸形成和l-精氨酸回收，使編碼控制l-精氨酸生物合成途徑的中心阻遏蛋白argr的基因argr失活。121、因此，質(zhì)粒pk18mobsacb_dargr構(gòu)建如下。使用xbai切割質(zhì)粒pk18mobsacb(1994)并使用“qiaquick?gel?extraction?kit”(qiagen?gmbh，hilden，germany)純化線性化載體dna(5721bp)。122、為了構(gòu)建插入物，通過(guò)pcr用以下引物對(duì)生成兩個(gè)dna片段(atcc13032的基因組dna作為模板)：123、dargr_lf(seq?id?no：9)，+dargr_lr(seq?id?no：10)124、＝左同源臂(983bp)125、dargr_rf(seq?id?no：11)，+dargr_rr(seq?id?no：12)126、＝左同源臂(984bp)127、使用“qia?quick?pcr?purification?kit”(qiagen?gmbh，hilden，germany)純化pcr產(chǎn)物。128、然后使用“nebuilder?hifi?dna′assembly?cloning?kit”(new?england?biolabsinc.，ipswich，usa，cat.no.e5520)組裝線性化質(zhì)粒和pcr產(chǎn)物。所得的缺失載體命名為pk18mobsacb_dargr。其通過(guò)限制性酶消化和dna測(cè)序驗(yàn)證。129、為了使argr基因缺失，通過(guò)電穿孔將pk18mobsacb_dargr轉(zhuǎn)化為谷氨酸棒狀桿菌atcc13032(kinoshita等，j.gen.appl.microbiol.1957；3(3)：193-205)。通過(guò)在補(bǔ)充有134g/l山梨醇、2.5g/l酵母提取物和25mg/l卡那霉素的bhi瓊脂上鋪板(plating)來(lái)選擇染色體整合(由第一重組事件產(chǎn)生)。將瓊脂平板在33℃孵育48h。130、將單個(gè)菌落轉(zhuǎn)移到新鮮瓊脂平板(具有25mg/l卡那霉素)上，并在33℃下孵育24小時(shí)。將這些克隆的液體培養(yǎng)物在33℃下在具有3個(gè)隔板的100ml?erlenmeyer中含有的10mlbhi培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)。為了分離遇到第二重組事件的克隆，從每個(gè)液體培養(yǎng)物中取出等分試樣，在補(bǔ)充有10％蔗糖的bhi瓊脂上適當(dāng)稀釋和鋪板(通常100μl至200μl)。這些瓊脂平板在33℃孵育48h。然后檢查在含有蔗糖的瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落的卡那霉素敏感性。為此，使用牙簽從菌落中除去細(xì)胞物質(zhì)并將其轉(zhuǎn)移到含有25mg/l卡那霉素的bhi瓊脂上和含有10％蔗糖的bhi瓊脂上。將瓊脂平板在33℃下孵育60h。131、通過(guò)pcr和dna測(cè)序檢查證明對(duì)卡那霉素敏感且對(duì)蔗糖有抗性的克隆。132、所得菌株命名為atcc13032_dargr。133、實(shí)施例4：用表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌atcc13032_dargr134、通過(guò)電穿孔用表達(dá)質(zhì)粒plib_p_agat-mp和plib_cyca_agat-mp轉(zhuǎn)化菌株atcc13032_dargr。用25mg/l卡那霉素選擇含質(zhì)粒的細(xì)胞。所得含質(zhì)粒的菌株在表6中示出。135、136、137、表6：含有谷氨酸棒狀桿菌atcc13032衍生物的質(zhì)粒138、實(shí)施例5：cyca的過(guò)表達(dá)對(duì)gaa產(chǎn)生的影響139、為了評(píng)估cyca的過(guò)表達(dá)對(duì)gaa產(chǎn)生的影響，在wouter?duetz系統(tǒng)中在不添加甘氨酸的生產(chǎn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株atcc13032_dargr/plib_p_agat-mp和atcc13032_dargr/plib_cyca_agat-mp，并且如上所述確定所得的gaa滴度。140、 菌株 gaa atcc13032_dargr/plib_p_agat-mp 96mg/l atcc13032_dargr/plib_cyca_agat-mp 143mg/l 141、表7：cyca的過(guò)表達(dá)對(duì)gaa產(chǎn)生的影響142、與atcc13032/plib_p_agat-mp相比，用含有cyca基因的質(zhì)粒培養(yǎng)菌株導(dǎo)致更高的gaa滴度(參見(jiàn)表7)。我們得出結(jié)論，cyca基因的過(guò)表達(dá)改善了gaa的產(chǎn)生。當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12