本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，更具體地，涉及一種用于解脂耶氏酵母中基因無標(biāo)記轉(zhuǎn)化的載體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、解脂耶氏酵母是一種重要的非常規(guī)酵母，其可利用包括甘油、葡萄糖、烴類、脂類和乙酸等多種類型的親水性或疏水性廉價(jià)碳源，對(duì)多種環(huán)境具有較強(qiáng)耐受性。解脂耶氏酵母擁有豐富的酶系系統(tǒng)，也具有較高的三羧酸循環(huán)通量，其體內(nèi)含有大量合成諸多天然產(chǎn)物所需的前體物質(zhì)乙酰輔酶a，且該酵母已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(food?and?drugadministration,fda)批準(zhǔn)為gras生物安全性微生物，目前已作為微生物宿主廣泛應(yīng)用于重組蛋白的高效表達(dá)及萜類、黃酮類、糖醇等代謝產(chǎn)物的合成。

2、為了構(gòu)建解脂耶氏酵母重組菌株以實(shí)現(xiàn)特定的生物學(xué)目的，通常需要利用遺傳篩選標(biāo)記進(jìn)行一系列改造以獲得含有目的基因改造的工程菌。目前，解脂耶氏酵母細(xì)胞內(nèi)可用的篩選標(biāo)記主要為抗生素標(biāo)記和營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，其中常用的抗生素標(biāo)記包括潮霉素b、諾爾絲菌素等，而營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記含ura3、leu2、trp1等。盡管隨著研究的深入，也有一些新的元件被陸續(xù)成功挖掘用于解脂耶氏酵母篩選，如dsda、sucb等，但仍然有限的篩選標(biāo)記給在該酵母體內(nèi)的多次迭代改造帶來了難題。此外，含有抗生素基因的重組菌株也不適于生產(chǎn)用于生物安全性要求較高的重組蛋白或代謝產(chǎn)物?？梢?，開發(fā)可用于解脂耶氏酵母中載體轉(zhuǎn)化后標(biāo)記基因回收的工具十分必要。

3、研究中常采用cre/loxp位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)在多種微生物體內(nèi)進(jìn)行無標(biāo)記基因操作，該系統(tǒng)通常需cre重組酶和一對(duì)loxp序列實(shí)現(xiàn)重組反應(yīng)。其中，loxp序列全長(zhǎng)34bp，其由兩端各13bp的反向重復(fù)序列及之間8bp的間隔序列構(gòu)成，間隔序列決定著loxp位點(diǎn)的方向和類型，cre重組酶可催化同一條dna鏈上兩個(gè)同向loxp位點(diǎn)之間發(fā)生剪接反應(yīng)，從而可將實(shí)現(xiàn)載體所引入的篩選標(biāo)記基因進(jìn)行回收。然而，使用cre/loxp系統(tǒng)進(jìn)行每輪標(biāo)記回收均會(huì)在基因組上殘留一個(gè)loxp序列的特性，使得直接利用該系統(tǒng)在單個(gè)宿主體內(nèi)進(jìn)行多次無標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化可能導(dǎo)致基因重排。為了克服這一問題，有研究通過對(duì)野生型loxp序列13bp反向重復(fù)序列進(jìn)行突變獲得了一些具有獨(dú)特性能的突變型lox位點(diǎn)，包括左臂突變型lox序列(如lox71，5’

4、-taccgttcgtatagcatacattatacgaagttat-3’)和右臂突變型lox位點(diǎn)(如lox66，5’-ataacttcgtatagcatacattatacgaacggta-3’)等，在一對(duì)突變型位點(diǎn)之間發(fā)生切除反應(yīng)可產(chǎn)生難以再次參與重組反應(yīng)的雙臂突變型lox位點(diǎn)(如lox72)，使得利用該cre重組系統(tǒng)進(jìn)行重復(fù)無標(biāo)記基因操作更可靠。到目前為止，研究中常采用如文獻(xiàn)[new?disruptioncassettes?for?rapid?gene?disruption?and?marker?rescue?in?the?yeast?yarrowialipolytica.journal?of?microbiological?methods,2003,55(3):727-737]中建立的cre重組方法該進(jìn)行解脂耶氏酵母中篩選標(biāo)記的回收。盡管可緩解篩選標(biāo)記有限的難題，但因其loxp序列與cre重組酶表達(dá)盒位于兩個(gè)不同的載體或片段，使用該方法完成基因整合后需額外轉(zhuǎn)化攜帶cre表達(dá)盒才能實(shí)現(xiàn)標(biāo)記的回收，這導(dǎo)致每輪無標(biāo)記基因整合均需利用兩種標(biāo)記基因進(jìn)行兩次轉(zhuǎn)化操作，實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)且操作相對(duì)復(fù)雜。不久前，專利文獻(xiàn)202210528110.x中公開了一種利用乳糖操縱序列l(wèi)aco抑制cre基因在大腸桿菌泄露表達(dá)，成功將誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控的cre基因表達(dá)盒與一對(duì)loxp序列構(gòu)建于單個(gè)載體，僅需單次轉(zhuǎn)化即可實(shí)現(xiàn)無標(biāo)記整合，有效地縮短了單次無標(biāo)記整合的周期。盡管如此，該方法必須依賴含laciq抑制子的大腸桿菌宿主才能有效抑制cre基因在大腸桿菌中的泄露，這極大限制了構(gòu)建該類型載體時(shí)可選擇的大腸桿菌宿主范圍，且當(dāng)宿主體內(nèi)laciq抑制不嚴(yán)謹(jǐn)時(shí)可能導(dǎo)致載體自身發(fā)生cre泄露表達(dá)后導(dǎo)致兩個(gè)lox序列之間重組而造成不穩(wěn)定的情況。此外，鑒于目前尚未在解脂耶氏酵母體內(nèi)鑒定出十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼T導(dǎo)型啟動(dòng)子，使用基于該方法構(gòu)建的載體進(jìn)行dna轉(zhuǎn)化后，在未誘導(dǎo)時(shí)即可能存在一定比例因啟動(dòng)子泄露導(dǎo)致cre重組剔除篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)化子，這難以兼顧需在特定時(shí)刻進(jìn)行標(biāo)記回收的不同研究場(chǎng)景。

5、因此，在克服上述技術(shù)不足的基礎(chǔ)上，開發(fā)一種可用于解脂耶氏酵母中基因無標(biāo)記轉(zhuǎn)化的方法，具有重要的實(shí)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的以上技術(shù)缺陷或改進(jìn)需求，本發(fā)明提供了一種用于解脂耶氏酵母中基因無標(biāo)記轉(zhuǎn)化的載體及其應(yīng)用，其目的在于更有效解決cre重組酶在大腸桿菌泄露的問題，并可根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需求更方便地利用單個(gè)載體實(shí)現(xiàn)該酵母中的無標(biāo)記整合。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種解脂耶氏酵母中基因無標(biāo)記轉(zhuǎn)化的載體，該載體包括誘導(dǎo)型cre基因表達(dá)盒，所述誘導(dǎo)型cre基因表達(dá)盒含由5’端至3’端方向的解脂耶氏酵母誘導(dǎo)型雜合啟動(dòng)子、cre基因和終止子；所述解脂耶氏酵母誘導(dǎo)型雜合啟動(dòng)子是由該酵母細(xì)胞內(nèi)可用的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子與含內(nèi)含子的啟動(dòng)子中intron片段融合而成。

3、所述載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌宿主后，解脂耶氏酵母誘導(dǎo)型雜合啟動(dòng)子中含有的啟動(dòng)子intron序列利用大腸桿菌不能識(shí)別剪切真核生物內(nèi)含子的原理，且通過其intron內(nèi)部含有的終止密碼子造成提前終止或通過使cre基因移碼的方式防止cre基因在大腸桿菌中的泄露表達(dá)；

4、優(yōu)選的，所述載體還包括：左臂突變型lox序列和/或大腸桿菌抗生素基因與復(fù)制起點(diǎn)和/或解脂耶氏酵母篩選標(biāo)記和/或右臂突變型lox序列和/或同源臂和/或目的基因表達(dá)盒。

5、優(yōu)選的，所述載體包括：左臂突變型lox序列、誘導(dǎo)型cre基因表達(dá)盒、右臂突變型lox序列。

6、優(yōu)選的，所述載體包括：所述載體包括：左臂突變型lox序列、誘導(dǎo)型cre基因表達(dá)盒、大腸桿菌抗生素基因與復(fù)制起點(diǎn)、解脂耶氏酵母篩選標(biāo)記、右臂突變型lox序列、同源臂。

7、最優(yōu)選的，所述載體包括：左臂突變型lox序列、誘導(dǎo)型cre基因表達(dá)盒、大腸桿菌抗生素基因與復(fù)制起點(diǎn)、解脂耶氏酵母篩選標(biāo)記、右臂突變型lox序列、同源臂和目的基因表達(dá)盒。

8、所述載體轉(zhuǎn)化入解脂耶氏酵母宿主后，所述解脂耶氏酵母誘導(dǎo)型雜合啟動(dòng)子中含有的啟動(dòng)子intron序列能通過內(nèi)含子剪接使得cre基因表達(dá)盒在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的調(diào)控下表達(dá)產(chǎn)生具有重組酶功能的蛋白；

9、所述解脂耶氏酵母誘導(dǎo)型雜合啟動(dòng)子中含有的啟動(dòng)子intron序列能調(diào)節(jié)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的強(qiáng)度，使得該誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控的cre基因表達(dá)盒在解脂耶氏酵母中泄露表達(dá)的程度增強(qiáng)或減弱；

10、優(yōu)選的，所述左臂突變型lox序列與右臂突變型lox序列具有相同的間隔序列，且在所述載體上具有相同的方向；

11、優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)型cre基因表達(dá)盒、大腸桿菌抗生素基因與復(fù)制起點(diǎn)、解脂耶氏酵母篩選標(biāo)記均位于所述載體上左臂突變型lox序列的3’端和所述右臂突變型lox序列的5’端之間；

12、優(yōu)選的，所述同源臂和目的基因表達(dá)盒均位于所述載體上左臂突變型lox序列的5’端和所述右臂突變型lox序列的3’端之間；

13、所述載體整合入解脂耶氏酵母宿主染色體后，所述載體含有的左臂突變型lox序列與右臂突變型lox序列能在cre重組酶的介導(dǎo)下發(fā)生切除反應(yīng)，并在宿主基因組留下難以再次參與cre重組反應(yīng)的雙臂突變型lox序列；

14、優(yōu)選的，所述解脂耶氏酵母誘導(dǎo)型雜合啟動(dòng)子為ppox2油酸型誘導(dǎo)啟動(dòng)子與該酵母中piclin啟動(dòng)子的內(nèi)含子雜合構(gòu)建而成。

15、優(yōu)選的，所述解脂耶氏酵母誘導(dǎo)型雜合啟動(dòng)子為ppox2油酸型誘導(dǎo)啟動(dòng)子與該酵母中pfbain啟動(dòng)子的內(nèi)含子雜合構(gòu)建而成。

16、優(yōu)選的，所述解脂耶氏酵母誘導(dǎo)型雜合啟動(dòng)子為ppox2油酸型誘導(dǎo)啟動(dòng)子與該酵母中ptefin啟動(dòng)子的內(nèi)含子雜合構(gòu)建而成。

17、優(yōu)選的，當(dāng)所述載體用于單交換整合時(shí)，所述同源臂為用于轉(zhuǎn)化的解脂耶氏酵母宿主基因組中的一段同源序列，且其內(nèi)部包括至少一個(gè)在所述載體上唯一存在的酶切位點(diǎn)a。

18、優(yōu)選的，當(dāng)所述載體用于雙交換整合時(shí)，所述同源臂為用于轉(zhuǎn)化的解脂耶氏酵母宿主基因組中目的位點(diǎn)下游同源序列和上游同源序列以5’至3’方向的融合序列，且下游同源序列和上游同源序列之間含有至少一個(gè)在所述載體同源臂區(qū)域外不存在的酶切位點(diǎn)b。

19、優(yōu)選的，當(dāng)所述載體用于雙交換基因敲除時(shí)，所述載體可不含有目的基因表達(dá)盒。

20、優(yōu)選的，所述解脂耶氏酵母篩選標(biāo)記為營(yíng)養(yǎng)缺陷型或抗生素篩選標(biāo)記。

21、優(yōu)選的，所述同源臂中各同源序列長(zhǎng)度至少為500bp。

22、根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了以上任一所述載體用于解脂耶氏酵母中基因無標(biāo)記轉(zhuǎn)化的應(yīng)用。

23、根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種解脂耶氏酵母中基因無標(biāo)記轉(zhuǎn)化的方法，所述方法包含以下步驟：

24、(1)轉(zhuǎn)化：用如前所述的載體對(duì)所述同源臂含有的酶切位點(diǎn)a或酶切位點(diǎn)b處做線性化處理后，轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母宿主，用所述載體含有的酵母篩選標(biāo)記對(duì)應(yīng)的篩選培養(yǎng)基進(jìn)行目的轉(zhuǎn)化子的篩選；

25、(2)誘導(dǎo)：將步驟(1)中獲得的轉(zhuǎn)化子接種于液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)，當(dāng)菌體生長(zhǎng)至明顯渾濁時(shí)，在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上通過稀釋涂布或連續(xù)劃線的方式分離菌液得到單菌落；所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基為不含所述篩選標(biāo)記的解脂耶氏酵母菌株也能正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)基；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為能誘導(dǎo)所述cre重組酶表達(dá)所需的培養(yǎng)基；

26、(3)鑒定：將步驟(2)中獲得的單菌落分別接種至步驟(1)采用的篩選培養(yǎng)基和步驟(2)所述的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，挑選能在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基良好生長(zhǎng)但無法在篩選培養(yǎng)基正常生長(zhǎng)的克隆子進(jìn)一步進(jìn)行基因組pcr驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的即為實(shí)現(xiàn)目標(biāo)無標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化的重組菌株。

27、優(yōu)選的，所述步驟(1)中采用的轉(zhuǎn)化方法為鋰轉(zhuǎn)化法或電轉(zhuǎn)化法。

28、優(yōu)選的，所述步驟(1)中獲得的轉(zhuǎn)化子經(jīng)過基因組pcr驗(yàn)證后再進(jìn)行步驟(2)。

29、優(yōu)選的，通過重復(fù)步驟(1)至步驟(3)，在單個(gè)宿主內(nèi)實(shí)現(xiàn)多輪無標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化。

30、總體而言，通過本發(fā)明所構(gòu)思的以上技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，主要具備以下的技術(shù)有點(diǎn)：

31、(1)此前，專利文獻(xiàn)202210528110.x中公開的技術(shù)利用乳糖操縱序列l(wèi)aco元件抑制cre基因在大腸桿菌中的泄露，而其必須依賴含laciq抑制子的大腸桿菌宿主，限定條件更多。而本發(fā)明設(shè)計(jì)的用于解脂耶氏酵母中基因無標(biāo)記轉(zhuǎn)化的載體，通過構(gòu)建解脂耶氏酵母誘導(dǎo)型雜合啟動(dòng)子，利用大腸桿菌不能識(shí)別剪切真核生物內(nèi)含子的原理，且intron序列內(nèi)部含有的終止密碼子造成提前終止或通過使cre基因移碼的方式可有效防止cre基因在大腸桿菌中的泄露表達(dá)。本發(fā)明是從基因編碼的角度出發(fā)抑制cre基因在大腸桿菌中的泄露表達(dá)，相比采用laco調(diào)控元件時(shí)的抑制更加嚴(yán)謹(jǐn)，可有效防止宿主體內(nèi)laciq抑制不嚴(yán)謹(jǐn)時(shí)可能導(dǎo)致載體自身發(fā)生cre重組而造成不穩(wěn)定的情況，可靠性更高。此外，本發(fā)明構(gòu)建基因的無標(biāo)記轉(zhuǎn)化載體不需依賴含laciq抑制子的大腸桿菌宿主，可選擇的大腸桿菌宿主范圍更廣，更利于實(shí)際操作應(yīng)用。

32、(2)鑒于目前尚未在解脂耶氏酵母體內(nèi)挖掘獲得十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼T導(dǎo)型啟動(dòng)子，使用如專利文獻(xiàn)202210528110.x中公開的技術(shù)直接利用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控cre基因，難以更精細(xì)地調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的強(qiáng)度，可能在未進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)即存在因啟動(dòng)子泄露表達(dá)導(dǎo)致cre重組剔除篩選標(biāo)記的事件。目前，解脂耶氏酵母中常使用營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記基因，而主要的營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記基因(如leu2、ura3等)對(duì)解脂耶氏酵母相應(yīng)缺陷型菌株的生長(zhǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)均可能具有不同程度的影響，當(dāng)某些研究需要先評(píng)價(jià)基因改造對(duì)菌株生長(zhǎng)、發(fā)酵的影響后再進(jìn)行缺陷型基因標(biāo)記回收時(shí)，若發(fā)酵過程中較多重組菌株因啟動(dòng)子泄露表達(dá)導(dǎo)致cre重組剔除了篩選標(biāo)記基因，則對(duì)發(fā)酵結(jié)果的可靠性造成較大影響。而本發(fā)明結(jié)合解脂耶氏酵母中啟動(dòng)子intron序列可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子強(qiáng)度的特性，設(shè)計(jì)構(gòu)建解脂耶氏酵母誘導(dǎo)型雜合啟動(dòng)子，通過啟動(dòng)子intron序列調(diào)節(jié)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的強(qiáng)度，可使誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控的cre基因表達(dá)盒在解脂耶氏酵母中泄露表達(dá)的程度增強(qiáng)或減弱，利用泄露增強(qiáng)的誘導(dǎo)雜合啟動(dòng)子可用于需要快速回收標(biāo)記時(shí)的場(chǎng)景，而利用泄露減弱的誘導(dǎo)雜合啟動(dòng)子可用于需要菌株相對(duì)穩(wěn)定，在需要時(shí)再回收標(biāo)記時(shí)的場(chǎng)景?？梢?，本專利中技術(shù)在解脂耶氏酵母中實(shí)現(xiàn)標(biāo)記回收的過程具有更強(qiáng)的調(diào)控性，可更好的兼顧需在特定時(shí)刻進(jìn)行標(biāo)記回收的不同研究場(chǎng)景。

33、(3)與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明僅需單個(gè)篩選標(biāo)記即可在解脂耶氏酵母中實(shí)現(xiàn)無標(biāo)記轉(zhuǎn)化，對(duì)篩選標(biāo)記的要求更少，對(duì)可選宿主的范圍更大。

34、(4)與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明每輪無標(biāo)記轉(zhuǎn)化均僅需單次轉(zhuǎn)化，有效縮短了實(shí)驗(yàn)周期且減少了實(shí)驗(yàn)工作量。

35、(5)采用本發(fā)明構(gòu)建的解脂耶氏酵母重組菌株，可不引入任何抗生素基因，更利于其在對(duì)生物安全性要求就高的工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用。