本發(fā)明屬于酶工程，具體涉及一種來源于魯杰氏菌(ruegeriasp.tm1040)的氨基轉(zhuǎn)移酶突變體及其制備手性內(nèi)酰胺類化合物的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、手性芳基胺及其類似物是一種重要的藥物合成前體，是很多api的重要合成前體，是多種處于臨床階段的創(chuàng)新化學藥的重要砌塊，比如cx-8998阿托戈潘、西那卡塞、西格列汀等等。此前的合成方法通常是以鈀、鉑、銠、釕等不可回收的貴金屬作為催化劑，成本較高，或者以鎳等重金屬作為催化劑，會對環(huán)境造成污染，且過程中需要在密閉反應(yīng)裝置中使用高壓氫氣，安全風險較高。與化學法相比，酶催化法具備特異性好、純度高、反應(yīng)溫和、成本低等特點，氨基轉(zhuǎn)移酶是用來合成手性芳基胺及其類似物的一種重要方法，綠色環(huán)保，且應(yīng)用較多，例如西他列汀的合成(science,2010,329,305-309-biocatalytic?asymmetricsynthesis?of?chiral?amines?from?ketones?applied?to?sitagliptin?manufacture)。

2、手性內(nèi)酰胺類化合物是一種重要的藥物合成前體，是多種處于臨床階段的創(chuàng)新化學藥的重要砌塊。

3、此前的合成方法需要多步化學反應(yīng)，步驟多、收率低、成本高、原子經(jīng)濟性差、對環(huán)境不友好，不是一條綠色可持續(xù)的合成路線；通過酶催化的方法來合成手性內(nèi)酰胺，可縮短路線至1步，且原子經(jīng)濟性高，反應(yīng)主要在水溶液中進行，安全環(huán)保，符合綠色化學原則。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中合成手性內(nèi)酰胺的化合物的化學方法成本高、原子經(jīng)濟性差，為此，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)氨酶的突變體及其應(yīng)用，采用該轉(zhuǎn)氨酶突變體制備手性內(nèi)酰胺化合物，收率可達85％以上，e.e.值可達98％以上，具有收率高、純度高，后處理簡便等優(yōu)點，對環(huán)境友好，可作為一條綠色可持續(xù)的合成路線。

2、本發(fā)明提供了一種化合物ii的制備方法，其包括以下步驟：在溶劑中，在轉(zhuǎn)氨酶的突變體存在下，將化合物i和氨基供體進行如下式所示的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)，得到化合物ii；

3、

4、其中，

5、r1、r2、r3、r4和r5獨立地為h、鹵素、氨基、c1-4烷基、羧基、羥基、c1-4烷氧基或硝基；

6、r6為c2-6烷基；

7、所述轉(zhuǎn)氨酶的突變體為在如seq?id?no:1所示的氨基酸序列上具有選自以下1個或多個位點的氨基酸殘基的差異：

8、第1位、第2位、第3位、第19位、第47位、第49位、第50位、第55位、第56位、第59位、第68位、第76位、第86位、第87位、第88位、第108位、第118位、第120位、第141位、第152位、第155位、第157位、第159位、第162位、第168位、第170位、第178位、第191位、第214位、第231位、第234位、第243位、第251位、第303位、第320位、第324位、第341位、第376位、第382位、第402位、第405位、第416位和第420位。

9、某一實施方案中，所述的差異為缺失、增加或替換，優(yōu)選為替換。

10、某一實施方案中，所述轉(zhuǎn)氨酶的突變體可為在如seq?id?no:1所示的氨基酸序列上具有選自以下1個或多個位點的氨基酸殘基的差異：

11、第1位、第2位、第3位、第19位、第47位、第49位、第56位、第59位、第76位、第86位、第87位、第88位、第108位、第118位、第120位、第141位、第152位、第155位、第157位、第159位、第162位、第168位、第178位、第214位、第231位、第234位、第243位、第303位、第320位、第324位、第341位、第376位、第382位、第405位和第420位。

12、某一實施方案中，所述轉(zhuǎn)氨酶的突變體為在如seq?id?no:1所示的氨基酸序列上具有選自以下1個或多個位點的氨基酸殘基的差異：

13、第2位、第3位、第19位、第47位、第49位、第59位、第76位、第86位、第87位、第88位、第108位、第118位、第120位、第141位、第152位、第155位、第157位、第162位、第168位、第178位、第214位、第231位、第234位、第243位、第303位、第320位、第324位、第341位、第382位和第420位。

14、某一實施方案中，所述轉(zhuǎn)氨酶的突變體為在如seq?id?no:1所示的氨基酸序列的第1位氨基酸殘基替換為a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、n、p、q、r、s、t、v或w；

15、和/或，第2位氨基酸殘基替換為a、c、d、e、f、g、h、i、k、m、q、r、s、t或y；

16、和/或，第3位氨基酸殘基替換為c、e、f、h、i、l、m、n、q、r、s、t、v、w或y；

17、和/或，第19位氨基酸殘基替換為a、d、e、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、t、v、w或y；

18、和/或，第47位氨基酸殘基替換為a、c、f、g、h、i、k、l、m、p、q、r、s、t、v、w或y；

19、和/或，第49位氨基酸殘基替換為a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、n、p、q、r、s、v、w或y；

20、和/或，第50位氨基酸殘基替換為a、c、d、e、f、h、i、l、m、n、p、q、r、s、t、v或w；

21、和/或，第55位氨基酸殘基替換為a、c、d、e、g、h、i、k、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y；

22、和/或，第56位氨基酸殘基替換為c、d、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y；

23、和/或，第59位氨基酸殘基替換為a、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v或w；

24、和/或，第68位氨基酸殘基替換為a、c、d、f、g、h、i、k、l、m、n、p、r、s、t、v、w或y；

25、和/或，第76位氨基酸殘基替換為a、c、e、f、g、h、i、k、l、n、p、q、r、s、t、v、w或y；

26、和/或，第86位氨基酸殘基替換為a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、n、q、r、t、v、w或y；

27、和/或，第87位氨基酸殘基替換為a、c、d、e、f、g、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t或v；

28、和/或，第88位氨基酸殘基替換為a、c、d、e、g、h、i、k、l、m、n、p、q、s、t或y；

29、和/或，第108位氨基酸殘基替換為a、c、e、f、g、l、n、p、q、r、s、t、v、w或y；

30、和/或，第118位氨基酸殘基替換為a、c、d、e、f、h、i、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y；

31、和/或，第120位氨基酸殘基替換為a、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、t、v、w或y；

32、和/或，第141位氨基酸殘基替換為a、c、d、f、g、h、i、k、m、n、r、s、t、v、w或y；

33、和/或，第152位氨基酸殘基替換為a、c、d、e、f、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v或w；

34、和/或，第155位氨基酸殘基替換為a、c、d、e、f、g、h、i、k、m、n、p、q、r、t、v或w；

35、和/或，第157位氨基酸殘基替換為a、d、e、f、g、h、i、k、m、n、p、q、r、s、t、v或y；

36、和/或，第159位氨基酸殘基替換為a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、p、q、r、s、v、w或y；

37、和/或，第162位氨基酸殘基替換為a、d、e、f、g、h、i、k、m、n、p、q、s、t、v、w或y；

38、和/或，第168位氨基酸殘基替換為a、c、e、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t或y；

39、和/或，第170位氨基酸殘基替換為a、c、d、e、f、g、h、i、l、m、n、q、r、s、t、v、w或y；

40、和/或，第178位氨基酸殘基替換為a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、p、r、s、t、v、w或y；

41、和/或，第191位氨基酸殘基替換為a、c、d、f、h、i、k、l、m、n、p、q、r、t、v或y；

42、和/或，第214位氨基酸殘基替換為a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、s、t、w或y；

43、和/或，第231位氨基酸殘基替換為a、c、e、f、i、k、l、m、n、p、q、r、s、v、w或y；

44、和/或，第234位氨基酸殘基替換為a、d、e、f、g、h、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y；

45、和/或，第243位氨基酸殘基替換為a、c、d、f、g、h、i、k、n、p、r、s、t、v、w或y；

46、和/或，第251位氨基酸殘基替換為a、c、d、e、f、g、h、i、l、m、n、p、r、s、t、v或w；

47、和/或，第303位氨基酸殘基替換為a、d、e、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、t、v、w或y；

48、和/或，第320位氨基酸殘基替換為a、c、d、e、f、g、h、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y；

49、和/或，第324位氨基酸殘基替換為c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t或y；

50、和/或，第341位氨基酸殘基替換為a、c、d、e、f、g、h、i、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y；

51、和/或，第376位氨基酸殘基替換為a、c、d、e、f、g、h、i、k、m、n、p、q、r、s、t或w；

52、和/或，第382位氨基酸殘基替換為a、c、d、e、f、g、i、m、n、p、q、r、s、t、v或y；

53、和/或，第402位氨基酸殘基替換為a、c、e、f、g、h、i、m、p、q、r、s、t、v、w或y；

54、和/或，第405位氨基酸殘基替換為a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、q、r、s、t、v、w或y；

55、和/或，第416位氨基酸殘基替換為a、d、e、f、g、h、n、p、q、r、v、w或y；

56、和/或，第420位氨基酸殘基替換為a、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、s、v、w或y。

57、某一實施方案中，所述轉(zhuǎn)氨酶的突變體可為在如seq?id?no:1所示的氨基酸序列的第1位氨基酸殘基替換為l；

58、和/或，第2位氨基酸殘基替換為d或g；

59、和/或，第3位氨基酸殘基替換為h或n；

60、和/或，第19位氨基酸殘基替換為a或w；

61、和/或，第47位氨基酸殘基替換為y；

62、和/或，第49位氨基酸殘基替換為n；

63、和/或，第56位氨基酸殘基替換為s；

64、和/或，第59位氨基酸殘基替換為l；

65、和/或，第76位氨基酸殘基替換為i；

66、和/或，第86位氨基酸殘基替換為a；

67、和/或，第87位氨基酸殘基替換為f；

68、和/或，第88位氨基酸殘基替換為a；

69、和/或，第108位氨基酸殘基替換為n；

70、和/或，第118位氨基酸殘基替換為s；

71、和/或，第120位氨基酸殘基替換為t；

72、和/或，第141位氨基酸殘基替換為r；

73、和/或，第152位氨基酸殘基替換為f；

74、和/或，第155位氨基酸殘基替換為a；

75、和/或，第157位氨基酸殘基替換為v；

76、和/或，第159位氨基酸殘基替換為s；

77、和/或，第162位氨基酸殘基替換為m；

78、和/或，第168位氨基酸殘基替換為a；

79、和/或，第178位氨基酸殘基替換為r；

80、和/或，第214位氨基酸殘基替換為y；

81、和/或，第231位氨基酸殘基替換為a；

82、和/或，第234位氨基酸殘基替換為m；

83、和/或，第243位氨基酸殘基替換為h；

84、和/或，第303位氨基酸殘基替換為n；

85、和/或，第320位氨基酸殘基替換為f；

86、和/或，第324位氨基酸殘基替換為m；

87、和/或，第341位氨基酸殘基替換為m；

88、和/或，第376位氨基酸殘基替換為i；

89、和/或，第382位氨基酸殘基替換為m；

90、和/或，第405位氨基酸殘基替換為r；

91、和/或，第420位氨基酸殘基替換為q或y。

92、某一實施方案中，所述轉(zhuǎn)氨酶的突變體為在如seq?id?no:1所示的氨基酸序列的第2位氨基酸殘基替換為g；

93、和/或，第3位氨基酸殘基替換為h；

94、和/或，第19位氨基酸殘基替換為w；

95、和/或，第47位氨基酸殘基替換為y；

96、和/或，第49位氨基酸殘基替換為n；

97、和/或，第59位氨基酸殘基替換為l；

98、和/或，第76位氨基酸殘基替換為i；

99、和/或，第86位氨基酸殘基替換為a；

100、和/或，第87位氨基酸殘基替換為f；

101、和/或，第88位氨基酸殘基替換為a；

102、和/或，第108位氨基酸殘基替換為n；

103、和/或，第118位氨基酸殘基替換為s；

104、和/或，第120位氨基酸殘基替換為t；

105、和/或，第141位氨基酸殘基替換為r；

106、和/或，第152位氨基酸殘基替換為f；

107、和/或，第155位氨基酸殘基替換為a；

108、和/或，第157位氨基酸殘基替換為v；

109、和/或，第162位氨基酸殘基替換為m；

110、和/或，第168位氨基酸殘基替換為a；

111、和/或，第178位氨基酸殘基替換為r；

112、和/或，第214位氨基酸殘基替換為y；

113、和/或，第231位氨基酸殘基替換為a；

114、和/或，第234位氨基酸殘基替換為m；

115、和/或，第243位氨基酸殘基替換為h；

116、和/或，第303位氨基酸殘基替換為n；

117、和/或，第320位氨基酸殘基替換為f；

118、和/或，第324位氨基酸殘基替換為m；

119、和/或，第341位氨基酸殘基替換為m；

120、和/或，第382位氨基酸殘基替換為m；

121、和/或，第420位氨基酸殘基替換為y。

122、在某一實施方案中，所述轉(zhuǎn)氨酶的突變體為在如seq?id?no:1所示的氨基酸序列上具有4個至31個位點的氨基酸殘基的差異；較佳地，所述轉(zhuǎn)氨酶的突變體為在如seq?idno:1所示的氨基酸序列上具有11個至27個位點的氨基酸殘基的差異；例如15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個或27個。

123、某一實施方案中，所述轉(zhuǎn)氨酶的突變體為在如seq?id?no:1所示的氨基酸序列上具有選自以下11個至27位點的氨基酸殘基的差異：

124、第1位、第2位、第3位、第19位、第47位、第49位、第56位、第59位、第76位、第86位、第87位、第88位、第108位、第118位、第120位、第141位、第152位、第155位、第157位、第159位、第162位、第168位、第178位、第214位、第231位、第234位、第243位、第303位、第320位、第324位、第341位、第376位、第382位、第405位和第420位；

125、較佳地，所述轉(zhuǎn)氨酶的突變體為在如seq?id?no:1所示的氨基酸序列上具有選自以下11個至27位點的氨基酸殘基的差異：

126、第1位、第2位、第3位、第19位、第47位、第49位、第56位、第59位、第76位、第86位、第87位、第88位、第108位、第118位、第120位、第141位、第152位、第155位、第157位、第159位、第162位、第168位、第178位、第214位、第231位、第234位、第243位、第303位、第320位、第324位、第341位、第376位、第382位、第405位和第420位；

127、且所述轉(zhuǎn)氨酶的突變體至少具有第19位、第59位、第86位、第87位、第88位、第152位、第155位、第168位、第231位、第234位和第382位點的氨基酸殘基的差異。

128、某一實施方案中，所述轉(zhuǎn)氨酶的突變體為在如seq?id?no:1所示的氨基酸序列上具有選自以下18個至27位點的氨基酸殘基的差異：第2位、第3位、第19位、第47位、第49位、第59位、第76位、第86位、第87位、第88位、第108位、第118位、第120位、第141位、第152位、第155位、第157位、第162位、第168位、第178位、第214位、第231位、第234位、第243位、第303位、第320位、第324位、第341位、第382位和第420位；

129、較佳地，所述轉(zhuǎn)氨酶的突變體為在如seq?id?no:1所示的氨基酸序列上具有選自以下18個至27位點的氨基酸殘基的差異：第2位、第3位、第19位、第47位、第49位、第59位、第76位、第86位、第87位、第88位、第108位、第118位、第120位、第141位、第152位、第155位、第157位、第162位、第168位、第178位、第214位、第231位、第234位、第243位、第303位、第320位、第324位、第341位、第382位和第420位；

130、且所述轉(zhuǎn)氨酶的突變體至少具有第19位、第59位、第86位、第87位、第88位、第108位、第118位、第120位、第152位、第155位、第168位、第231位、第234位、第303位、第324位、第341位、第382位和第420位的差異。

131、某一實施方案中，所述轉(zhuǎn)氨酶的突變體在如seq?id?no:1所示的氨基酸序列上的差異如表1所示：

132、表1

133、

134、

135、

136、

137、

138、在某一實施方案中，所述鹵素獨立地可為氟、氯、溴或碘。

139、在某一實施方案中，所述c1-4烷基獨立地可為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基或叔丁基。

140、在某一實施方案中，所述c1-4烷氧基獨立地可為甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、異丁氧基或叔丁氧基。

141、在某一實施方案中，所述c2-6烷基獨立地可為乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基或叔丁基。

142、在某一實施方案中，r1、r2、r3、r4和r5為h。

143、在某一優(yōu)選方案中，所述化合物i和化合物ii選自以下方案中的任一種：

144、方案1：化合物i為化合物ii為

145、方案2：化合物i為化合物ii為

146、方案3：化合物i為化合物ii為

147、方案4：化合物i為化合物ii為

148、方案5：化合物i為化合物ii為

149、方案6：化合物i為化合物ii為

150、所述溶劑為本領(lǐng)域此類反應(yīng)常規(guī)的溶劑，較佳地，所述溶劑為緩沖液；更佳地，所述溶劑選自硼酸鈉緩沖液、磷酸鉀緩沖液、三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液和三乙醇胺鹽緩沖液中的一種或多種；最佳地，所述溶劑為硼酸鈉緩沖液、三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液或三乙醇胺鹽緩沖液。

151、在某一實施方案中，所述溶劑與所述化合物i的體積質(zhì)量比值為(0.01-1)l/g；例如(0.05～0.5)l/g；再例如0.05l/g或0.1l/g。

152、所述的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)中，所述氨基供體為本領(lǐng)域此類反應(yīng)常規(guī)的氨基供體，較佳地，所述氨基供體選自異丙胺、l-丙氨酸、dl-丙氨酸、l-賴氨酸、dl-賴氨酸、(s)-1-苯乙胺、(r)-1-苯乙胺、(rs)-1-苯乙胺、戊二胺、鄰苯二甲胺、鄰苯二甲胺鹽酸鹽、2-(4-硝基苯)乙胺和2-(4-硝基苯)乙胺鹽酸鹽中的一種或多種，更佳地，為異丙胺。

153、在某一優(yōu)選方案中，所述氨基供體與所述化合物i的摩爾比為(3-30)：1；例如(10-25):1，再例如11:1、12:1、21:1、22:1或23:1。

154、在某一優(yōu)選方案中，所述氨基供體和所述溶劑以氨基供體的溶液的形式參與反應(yīng)，較佳地，所述氨基供體的溶液中，所述氨基供體的摩爾濃度為0.1～1.5mol/l，例如0.2～1mol/l，再例如1mol/l。

155、在某一優(yōu)選方案中，所述氨基供體的溶液的ph值為6.0-11.0，例如7-10.0，優(yōu)選為8.5、9或9.5。

156、在某一優(yōu)選方案中，所述轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的反應(yīng)體系中還包括輔酶，所述輔酶為本領(lǐng)域常規(guī)的氨基轉(zhuǎn)移酶的輔酶，例如磷酸吡哆醛。

157、在某一優(yōu)選方案中，所述輔酶與所述化合物i的摩爾比為(0.001-1):1，例如(0.002-0.25):1，再例如0.009:1、0.017:1、0.018:1或0.019:1。

158、在某一優(yōu)選方案中，所述轉(zhuǎn)氨酶的突變體的質(zhì)量與化合物i的質(zhì)量比為(0.01-1):1，例如(0.02-0.5):1，再例如0.02:1、0.2:1或0.5:1。

159、在某一優(yōu)選方案中，所述轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的溫度為20-55℃，例如為25-50℃，再例如27℃、37℃或47℃。

160、所述轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的進程采用本領(lǐng)域此類反應(yīng)常規(guī)的監(jiān)測方法(例如tlc或upcc)進行檢測，所述的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的時間以所述化合物i消失或不再反應(yīng)為反應(yīng)終點，其可為4-50h，例如24h。

161、某一優(yōu)選方案中，所述化合物ii的制備方法包括以下步驟：在所述的溶劑中，在所述轉(zhuǎn)氨酶的突變體和所述輔酶存在下，將所述化合物i與所述氨基供體進行轉(zhuǎn)氨反應(yīng)，得到所述化合物ii。

162、某一優(yōu)選方案中，所述轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的反應(yīng)體系由所述溶劑、所述轉(zhuǎn)氨酶的突變體、所述輔酶、所述化合物i和所述的氨基供體組成。

163、某一優(yōu)選方案中，所述化合物ii的制備方法，其包括以下步驟：

164、(a)將所述輔酶、緩沖液和氨基供體進行混合，得到混合液；

165、(b)所述化合物i、所述轉(zhuǎn)氨酶的突變體和與所述步驟(a)得到的混合液進行混合，進行所述轉(zhuǎn)氨反應(yīng)，得到所述化合物ii。

166、所述轉(zhuǎn)氨反應(yīng)還包括后處理步驟，所述后處理為本領(lǐng)域此類反應(yīng)常規(guī)的后處理；較佳地，所述后處理包括下述步驟中的一種或多種：調(diào)ph值(例如用氫氧化鉀調(diào)節(jié)ph＝13)、萃取(例如甲基叔丁基醚)和濃縮(例如減壓蒸餾)。

167、本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)氨酶的突變體，所述轉(zhuǎn)氨酶的突變體滿足以下條件(1)和條件(2)：

168、條件(1)：所述轉(zhuǎn)氨酶的突變體為在如seq?id?no:1所示的氨基酸序列上具有選自以下1個或多個位點的氨基酸殘基的差異：

169、第1位、第2位、第3位、第19位、第47位、第49位、第50位、第55位、第56位、第59位、第68位、第76位、第86位、第87位、第88位、第108位、第118位、第120位、第141位、第152位、第155位、第157位、第159位、第162位、第168位、第170位、第178位、第191位、第214位、第231位、第234位、第243位、第251位、第303位、第320位、第324位、第341位、第376位、第382位、第402位、第405位、第416位和第420位；

170、條件(2)：所述轉(zhuǎn)氨酶的突變體為在如seq?id?no:1所示的氨基酸序列上至少具有1個選自以下位點的氨基酸殘基的差異：

171、所述1個位點選自第1位、第2位、第3位、第19位、第47位、第49位、第50位、第56位、第68位、第76位、第86位、第88位、第108位、第118位、第120位、第141位、第155位、第157位、第162位、第168位、第170位、第178位、第191位、第214位、第243位、第251位、第303位、第320位、第324位、第341位、第376位、第382位、第402位、第405位、第416位和第420位。

172、所述轉(zhuǎn)氨酶的突變體的定義還可如本發(fā)明任一方案中所述。

173、本發(fā)明還提供了一種分離的核酸，其中所述核酸的多核苷酸序列編碼如上所述的轉(zhuǎn)氨酶的突變體。

174、本發(fā)明還提供了一種重組表達載體，其中所述重組表達載體包含如上所述的核酸。

175、本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)化體，其中所述轉(zhuǎn)化體包含如上所述的重組表達載體。

176、本發(fā)明還提供了一種制備如上所述的轉(zhuǎn)氨酶的突變體的方法，其培養(yǎng)如上所述的轉(zhuǎn)化體并獲得含轉(zhuǎn)氨酶的突變體的培養(yǎng)物。

177、本發(fā)明還提供了一種如上所述的轉(zhuǎn)氨酶的突變體在制備手性內(nèi)酰胺類化合物中的應(yīng)用。較佳地，所述的手性內(nèi)酰胺類化合物為如上所述化合物ii。

178、本發(fā)明中的氨基酸簡寫符號如無特殊說明均為本領(lǐng)域常規(guī)，具體簡寫符號對應(yīng)的氨基酸如表2所示。

179、表2

180、

181、在不違背本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。

182、本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。

183、本發(fā)明的積極進步效果在于：本發(fā)明從野生型的氨基轉(zhuǎn)基酶催化得到的是s手性內(nèi)酰胺(轉(zhuǎn)化率＜1％)，經(jīng)過定向進化得到若干催化活性更好的(s)-手性內(nèi)酰胺(轉(zhuǎn)化率≥90％，e.e.≥98％)、熱耐受性更好的突變體，目標產(chǎn)物收率可達85％以上，可作為一條綠色可持續(xù)的合成路線，具有較高的工業(yè)應(yīng)用價值。