本發(fā)明涉及腫瘤免疫治療領(lǐng)域，特別是涉及一種靶向具核梭桿菌膜蛋白foma的mrna疫苗及其在食管鱗狀細(xì)胞癌免疫治療中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種通過(guò)靶向腫瘤微環(huán)境中的特定微生物膜蛋白，重塑腫瘤免疫微環(huán)境的新型治療策略。

背景技術(shù)：

1、食管鱗狀細(xì)胞癌(escc)是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，全球發(fā)病率和死亡率較高，尤其在亞洲國(guó)家。近年來(lái)研究表明，腫瘤微環(huán)境中的微生物組成與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。具核梭桿菌(fusobacterium?nucleatum)作為一種厭氧革蘭氏陰性菌，在多種癌癥中被發(fā)現(xiàn)異常富集，特別是在食管鱗狀細(xì)胞癌中與不良預(yù)后顯著相關(guān)。

2、具核梭桿菌通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。如學(xué)術(shù)論文"fusobacterium?nucleatumpromotes?esophageal?squamous?cell?carcinoma?progression?via?the?nod1/ripk2/nf-κb?pathway"所述，具核梭桿菌可通過(guò)nod1/ripk2通路激活nf-κb，導(dǎo)致食管鱗癌進(jìn)展。另有研究發(fā)現(xiàn)，具核梭桿菌還可通過(guò)ahr/cyp1a1/akt信號(hào)促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞增殖。這些研究表明，靶向具核梭桿菌可能是食管鱗癌治療的有效策略。

3、foma是具核梭桿菌表面的一種主要膜蛋白，在細(xì)菌與宿主相互作用中起關(guān)鍵作用。foma蛋白分子量約為40kda，由約360個(gè)氨基酸殘基組成，其中包含多個(gè)跨膜區(qū)域和表面暴露的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。這些表面暴露的區(qū)域可作為潛在的免疫表位。學(xué)術(shù)論文"rna?landscapeof?the?emerging?cancer-associated?microbe?fusobacterium?nucleatum"發(fā)現(xiàn)了一種保守的梭桿菌氧誘導(dǎo)小rna（foxi），作為主要外膜孔蛋白foma的轉(zhuǎn)錄后抑制因子，揭示了foma蛋白在具核梭桿菌生理過(guò)程中的重要性。通過(guò)生物信息學(xué)分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)foma蛋白含有多個(gè)富含甘氨酸的重復(fù)序列區(qū)域，這些區(qū)域在不同菌株間高度保守，且具有良好的親水性和表面可及性，可能是理想的免疫表位候選區(qū)域。

4、目前，針對(duì)腫瘤微環(huán)境中微生物的治療策略主要集中在抗生素治療和傳統(tǒng)疫苗方面。cn105779471a公開(kāi)了一種克隆和表達(dá)具核梭桿菌ahpc蛋白的方法，用于癌癥診斷和疫苗研發(fā)。然而，該方法僅針對(duì)ahpc蛋白，未涉及foma膜蛋白，且采用傳統(tǒng)蛋白質(zhì)疫苗技術(shù)，存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)、免疫原性不足等缺點(diǎn)。此外，ahpc蛋白主要位于細(xì)菌胞內(nèi)，不如膜蛋白foma更易被免疫系統(tǒng)識(shí)別，因此作為疫苗靶點(diǎn)的效果可能有限。

5、wo2019170837a1提出了一種基于外膜囊泡的異源多肽遞送系統(tǒng)，包含細(xì)菌蛋白fhud2和一個(gè)或多個(gè)異源多肽拷貝的融合蛋白。該技術(shù)雖然可用于腫瘤的預(yù)防或治療，但使用的是fhud2而非foma蛋白，且外膜囊泡制備工藝復(fù)雜，批次一致性難以控制，安全性存在隱患。外膜囊泡中含有多種細(xì)菌成分，可能引起過(guò)強(qiáng)的炎癥反應(yīng)或自身免疫反應(yīng)，限制了其臨床應(yīng)用。

6、傳統(tǒng)疫苗技術(shù)（如蛋白質(zhì)疫苗、多肽疫苗）在靶向細(xì)菌膜蛋白方面存在多種局限性：1）蛋白質(zhì)表達(dá)和純化過(guò)程復(fù)雜，成本高；2）蛋白質(zhì)穩(wěn)定性差，儲(chǔ)存條件苛刻；3）免疫原性可能不足，需要添加佐劑；4）難以精確控制體內(nèi)表達(dá)水平和持續(xù)時(shí)間。相比之下，mrna疫苗技術(shù)具有生產(chǎn)周期短、可快速調(diào)整序列、安全性好等優(yōu)勢(shì)，已在新冠疫苗等領(lǐng)域取得成功應(yīng)用。然而，目前尚未見(jiàn)將mrna疫苗技術(shù)應(yīng)用于靶向具核梭桿菌膜蛋白foma的報(bào)道。

7、綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)中缺乏一種能夠特異性靶向具核梭桿菌膜蛋白foma、具有良好免疫原性和安全性的疫苗，特別是針對(duì)食管鱗癌患者的個(gè)體化免疫治療方案。因此，開(kāi)發(fā)一種基于mrna技術(shù)的、靶向foma蛋白特定表位的疫苗，對(duì)于食管鱗癌的免疫治療具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、1、技術(shù)問(wèn)題

2、鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種靶向具核梭桿菌膜蛋白foma的mrna疫苗及其制備方法和應(yīng)用，以解決以下技術(shù)問(wèn)題：

3、1.?如何從具核梭桿菌foma蛋白中鑒定并設(shè)計(jì)具有高度特異性和免疫原性的表位，確保疫苗能夠特異性靶向具核梭桿菌而不影響正常菌群；

4、2.?如何通過(guò)優(yōu)化表位設(shè)計(jì)，特別是利用重復(fù)序列結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)疫苗的免疫原性，提高抗腫瘤效果；

5、3.?如何利用mrna疫苗技術(shù)遞送foma特異性表位，確保良好的安全性、穩(wěn)定性和有效性；

6、4.?如何針對(duì)食管鱗癌患者，特別是具核梭桿菌富集型患者，提供個(gè)體化的免疫治療方案，并與現(xiàn)有治療手段形成協(xié)同效應(yīng)。

7、2、技術(shù)方案

8、為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種靶向具核梭桿菌膜蛋白foma的mrna疫苗，所述mrna疫苗包含編碼具核梭桿菌膜蛋白foma特定表位的核苷酸序列，其中所述特定表位包含1-10個(gè)"ggsggggsgg"重復(fù)序列，所述重復(fù)序列在不同具核梭桿菌菌株中序列同源性大于95%；所述mrna被包封在脂質(zhì)納米顆粒中，所述脂質(zhì)納米顆粒的粒徑為80-150nm，多分散系數(shù)小于0.3，通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定。

9、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述特定表位選自以下序列：(a)包含3個(gè)"ggsggggsgg"重復(fù)序列的foma蛋白片段1，其氨基酸序列為seq?id?no:1；或(b)包含7個(gè)"ggsggggsgg"重復(fù)序列的foma蛋白片段2，其氨基酸序列為seq?id?no:2。

10、在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述mrna包含5'帽結(jié)構(gòu)、5'非翻譯區(qū)、編碼具核梭桿菌膜蛋白foma特定表位的開(kāi)放閱讀框、3'非翻譯區(qū)和poly(a)尾；其中所述5'帽結(jié)構(gòu)為m7g帽結(jié)構(gòu)，所述m7g帽結(jié)構(gòu)通過(guò)5'-5'三磷酸鍵與mrna的5'端連接，所述帽結(jié)構(gòu)的甲基化程度為95％以上，通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定。

11、在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式中，所述5'非翻譯區(qū)選自人β-球蛋白5'utr、人α-球蛋白5'utr或檸檬草香茅醇合酶5'utr；所述5'非翻譯區(qū)包含kozak序列，序列為5'-gccacc-3'。所述3'非翻譯區(qū)選自人β-球蛋白3'utr、人α-球蛋白3'utr或人生長(zhǎng)激素3'utr；所述3'非翻譯區(qū)含有au富集元件，序列為5'-auuua-3'的重復(fù)序列。

12、在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述脂質(zhì)納米顆粒包含以下組分及其質(zhì)量比例：陽(yáng)離子脂質(zhì)38-42％、中性脂質(zhì)18-22％、膽固醇33-37％和peg修飾的脂質(zhì)3-5％；其中所述陽(yáng)離子脂質(zhì)選自dotap、dotma或離子化的mc3，所述中性脂質(zhì)選自dope、dspc或dopc，所述peg修飾的脂質(zhì)選自dmg-peg2000或dspe-peg2000；所述脂質(zhì)納米顆粒的mrna包封率為85-95％，通過(guò)ribogreen熒光定量法測(cè)定。

13、本發(fā)明還提供了一種制備上述mrna疫苗的方法，包括以下步驟：

14、(1)?設(shè)計(jì)并合成編碼具核梭桿菌膜蛋白foma特定表位的核苷酸序列；

15、(2)?構(gòu)建含有所述核苷酸序列的dna模板，所述dna模板包含t7啟動(dòng)子序列、5'utr序列、編碼foma特定表位的開(kāi)放閱讀框、3'utr序列和poly(a)尾序列；

16、(3)?利用體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)從所述dna模板合成mrna，其中所述體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在37±1℃條件下進(jìn)行2-4小時(shí)，反應(yīng)體系包含1-5μg/ml線(xiàn)性化dna模板、7.5-10mm核糖核苷三磷酸混合物、40-60u/ml?t7?rna聚合酶、1-2u/μl?rnase抑制劑和5-10mm二硫蘇糖醇；

17、(4)?通過(guò)凝膠過(guò)濾色譜或高效液相色譜純化所述mrna，所述純化后的mrna純度大于95％，通過(guò)變性瓊脂糖凝膠電泳分析；

18、(5)?將所述mrna與脂質(zhì)組分混合，通過(guò)微流控技術(shù)制備包封有mrna的脂質(zhì)納米顆粒，其中所述微流控技術(shù)使用流速比為1:3-1:5的水相與有機(jī)相，混合溫度為20-30℃，混合后立即進(jìn)行透析或切向流過(guò)濾去除有機(jī)溶劑；

19、(6)?將所述脂質(zhì)納米顆粒制備成藥物制劑，所述制劑的滲透壓為280-320mosm/kg，ph值為7.2-7.6，內(nèi)毒素含量低于0.5eu/ml，通過(guò)鱟試劑法測(cè)定。

20、本發(fā)明還提供了上述mrna疫苗在制備用于治療梭菌富集型食管鱗癌的藥物中的應(yīng)用，其中梭菌富集型食管鱗癌是指患者腫瘤組織中具核梭桿菌的相對(duì)豐度高于正常組織的3倍以上，通過(guò)定量pcr方法測(cè)定，使用針對(duì)具核梭桿菌16s?rrna基因的特異性引物，以總細(xì)菌16s?rrna基因?yàn)閮?nèi)參，按照2^(-δδct)方法計(jì)算。其中，δδct?=?[ct(腫瘤組織中具核梭桿菌16s?rrna)?-?ct(腫瘤組織中總細(xì)菌16s?rrna)]?-?[ct(正常組織中具核梭桿菌16s?rrna)?-?ct(正常組織中總細(xì)菌16s?rrna)]，通過(guò)此計(jì)算可得到腫瘤組織相對(duì)于正常組織中具核梭桿菌的相對(duì)豐度倍數(shù)。

21、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述mrna疫苗與免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合使用，其中所述聯(lián)合使用方案為先給予mrna疫苗50μg/kg體重，每2周一次，共3次，第6周開(kāi)始給予免疫檢查點(diǎn)抑制劑標(biāo)準(zhǔn)劑量，每3周一次，共4次；所述免疫檢查點(diǎn)抑制劑選自pd-1抑制劑、pd-l1抑制劑和ctla-4抑制劑中的至少一種，所述pd-1抑制劑選自納武利尤單抗、帕博利珠單抗或卡瑞利珠單抗，所述pd-l1抑制劑選自阿替利珠單抗或度伐利尤單抗，所述ctla-4抑制劑為伊匹木單抗。

22、3、有益效果

23、本發(fā)明提供的靶向具核梭桿菌膜蛋白foma的mrna疫苗具有以下有益效果：

24、1.?特異性靶向效果：本發(fā)明通過(guò)生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，從foma蛋白中鑒定出"ggsggggsgg"重復(fù)序列作為特異性表位，該序列在具核梭桿菌中高度保守（序列同源性>95%），而在人體共生菌群中的同源性低于30%。通過(guò)16s?rrna測(cè)序分析證實(shí)，本發(fā)明的mrna疫苗能夠特異性降低腫瘤組織中具核梭桿菌的相對(duì)豐度72.4±8.0%，而對(duì)其他菌群的影響小于10±2%。這種高特異性靶向效果避免了廣譜抗生素治療可能導(dǎo)致的菌群失調(diào)問(wèn)題。

25、2.?表位重復(fù)序列增效作用：本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)包含多重重復(fù)"ggsggggsgg"序列的表位，顯著增強(qiáng)了疫苗的免疫原性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，包含7個(gè)重復(fù)序列的foma蛋白片段2相比包含3個(gè)重復(fù)序列的片段1能夠誘導(dǎo)2.1±0.2倍的特異性t細(xì)胞增殖反應(yīng)，并產(chǎn)生2.2±0.3倍的干擾素-γ分泌量。系統(tǒng)測(cè)試含有1、2、3、5、7、9個(gè)重復(fù)序列的mrna疫苗的免疫原性，結(jié)果顯示7個(gè)重復(fù)序列為臨界點(diǎn)，此時(shí)t細(xì)胞增殖指數(shù)達(dá)到3.8±0.5，而增加到9個(gè)重復(fù)序列后，增殖指數(shù)僅增加4.2±0.8%。這種表位重復(fù)序列增效作用是由于多重重復(fù)序列形成了多價(jià)表位，增加了與抗原呈遞細(xì)胞和t細(xì)胞受體的結(jié)合機(jī)會(huì)，從而增強(qiáng)了免疫應(yīng)答強(qiáng)度。

26、3.?mrna遞送安全性?xún)?yōu)勢(shì)：本發(fā)明采用mrna疫苗技術(shù)，避免了活細(xì)菌或細(xì)菌蛋白直接接觸的安全風(fēng)險(xiǎn)。mrna在體內(nèi)表達(dá)后產(chǎn)生的蛋白質(zhì)能夠被機(jī)體識(shí)別并誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，但mrna本身會(huì)在短時(shí)間內(nèi)降解，降低了長(zhǎng)期安全性風(fēng)險(xiǎn)。體內(nèi)追蹤實(shí)驗(yàn)顯示，注射后的mrna在24±3小時(shí)內(nèi)表達(dá)量達(dá)到峰值，72±6小時(shí)后降至檢測(cè)限以下，而產(chǎn)生的抗體滴度可維持8±1周以上。安全性評(píng)估顯示，在治療劑量范圍內(nèi)（5-50μg/kg體重），mrna疫苗未引起明顯的毒性反應(yīng)或自身免疫反應(yīng)，血清中il-6和tnf-α水平輕度升高（分別為120±20pg/ml和65±10pg/ml），但在24-48小時(shí)內(nèi)恢復(fù)正常。

27、4.?微環(huán)境重塑效應(yīng)：本發(fā)明的mrna疫苗通過(guò)靶向腫瘤微環(huán)境中的具核梭桿菌，實(shí)現(xiàn)了腫瘤免疫微環(huán)境的重塑。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，接受mrna疫苗治療后，腫瘤微環(huán)境從免疫抑制型向免疫活化型轉(zhuǎn)變，表現(xiàn)為cd8+?t細(xì)胞比例從5.2±1.0%增加到14.5±2.0%，調(diào)節(jié)性t細(xì)胞比例從15.5±2.0%減少到8.2±1.5%，m1/m2巨噬細(xì)胞比值從0.5±0.1增加到1.2±0.2，促炎細(xì)胞因子il-12水平從25±5pg/mg升高到65±10pg/mg，抑制性細(xì)胞因子il-10水平從120±15pg/mg降低到75±10pg/mg。這種微環(huán)境重塑效應(yīng)為后續(xù)免疫治療創(chuàng)造了有利條件。

28、5.?免疫檢查點(diǎn)協(xié)同增效作用：本發(fā)明的mrna疫苗與免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合使用，表現(xiàn)出顯著的協(xié)同增效作用。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，mrna疫苗通過(guò)降低具核梭桿菌豐度減少了腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制性細(xì)胞因子水平，同時(shí)增加了腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞數(shù)量，這與pd-1抑制劑解除t細(xì)胞耗竭的作用形成協(xié)同效應(yīng)，共同增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答。聯(lián)合治療組的客觀緩解率為70%（7/10），而單獨(dú)使用pd-1抑制劑組為30%（3/10），提高了2.33倍，腫瘤體積減少率從55.0±6.5%提高到78.5±8.0%。時(shí)序依賴(lài)性實(shí)驗(yàn)證明，先使用mrna疫苗2周后再使用pd-1抑制劑的方案效果最佳，客觀緩解率比同時(shí)給藥方案高20±3%，比pd-1抑制劑先給藥方案高35±4%。

29、6.?個(gè)體化治療策略：本發(fā)明提供了基于微生物豐度的個(gè)體化治療策略，提高了治療的精準(zhǔn)性和有效性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在具核梭桿菌豐度為正常組織1-3倍的患者中，mrna疫苗的腫瘤體積減少率為15.2±3.5%；在豐度為3-5倍的患者中，減少率為38.5±5.0%；在豐度大于5倍的患者中，減少率達(dá)到52.8±6.5%。這表明mrna疫苗對(duì)具核梭桿菌富集型患者（豐度>3倍）具有更好的治療效果，支持基于微生物豐度的個(gè)體化治療策略。